以即時反轉錄-聚合酶連鎖反應技術鑑別與檢測甜椒之馬鈴薯 Y 病毒及番椒斑駁病毒.pdf - 農業知識入口網

台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(1):11–18 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202203_71(1).0002
以即時反轉錄-聚合酶連鎖反應技術鑑別與檢測甜椒之
馬鈴薯 Y 病毒及番椒斑駁病毒
關政平1,*　鄭櫻慧2　蔡佳欣3　曾清山1　楊佐琦4
摘要
關政平、鄭櫻慧、蔡佳欣、曾清山、楊佐琦。2022。以即時反轉錄-聚合酶連鎖反應技術
鑑別與檢測甜椒之馬鈴薯Y病毒及番椒斑駁病毒。台灣農業研究71(1):11–18。
本研究利用real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)核酸增幅技術，首次建立可
鑑定和區分馬鈴薯Y病毒 (potato virus Y) 及番椒斑駁病毒 (pepper mottle virus) 之方法。結果顯示本核酸增幅
技術，可同時偵測甜椒罹染馬鈴薯Y病毒及番椒斑駁病毒，與其他茄科病毒及健康之植物無反應，對於單一
或是複合感染皆可鑑定，由結果顯示此核酸增幅技術具有專一性佳及靈敏度高等優點，且可用於定量病毒在
罹病組織內之濃度，將可應用於田間番椒罹染此2種病毒之監測。
關鍵詞：馬鈴薯Y病毒、番椒斑駁病毒、偵測、Real-time RT-PCR增幅技術。
前言 紋病徵，影響果實產量與品質。在田間，甜椒
被 2 種或是 2 種以上病毒的感染相當常見，
馬鈴薯Y屬病毒 (Potyvirus) 為Potyviridae
多重病毒感染率甚至可到90% (Abdalla et al.
科之絲狀病毒基因體，長度約 737 nm × 11
1991)。
nm 之單股RNA基因體，分子量大小約10 kb
PepMoV和PVY由蚜蟲以非持久方式傳播
(Shukla et al. 1994)。Potyvirus 感 染 茄 科 作
而感染茄科作物 (Han et al. 2006)；田間常見
物，造成世界性病害，包括馬鈴薯 (Solanum
PepMoV 感染甜椒造成重大損失 (Kim et al.
tuberosum L.)、甜椒 (Capsicum spp.) 和番茄
2009)。而PVY被認為是影響全世界經濟最重要
(Lycopersicon esculentum Mill.) 等作物之損失
的病毒之一 (Scholthof et al. 2011; Quenouille
(Benner et al. 1985)。此屬病毒與馬鈴薯病毒
有血清學上之關係 (Purcifull et al. 1975)。在台 et al. 2013)，除感染馬鈴薯引起損失外，且威
灣，田間感染番椒作物的病毒則有馬鈴薯Y病 脅番茄和番椒等作物生產 (Scholthof et al. 2011;
毒 (potato virus Y; PVY) (Lee 1970)、番椒葉脈 Crosslin 2012; Quenouille et al. 2013)。
斑駁病毒 (pepper veinal mottle virus) (Cheng 目前植物病毒常見之檢測方法包括酵素
et al. 2009)、辣椒葉脈斑駁病毒 (chilli veinal 連結抗體免疫標誌法 (enzyme-linked immu-
mottle virus) 和番椒斑駁病毒 (pepper mottle nosorbent assay; ELISA) (Dietzgen & Thomas
virus; PepMoV) (Cheng et al. 2011, 2013) 等。 1991; Kubota et al. 2011)、反轉錄聚合酶連
許多番椒病毒病癥不易區分，在感染初期植株 鎖反應法 (reverse transcription-polymerase chain
葉片產生小型黃斑，病斑逐漸擴大形成綠色嵌 reaction; RT-PCR) (Gyoutoku et al. 2009) 等，
投稿日期：2021 年4月14日；接受日期：2021 年10月12日。
* 通訊作者：pcr123@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所生物技術組副研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所植物病理組副研究員。台灣 台中市。
3 農委會農業試驗所植物病理組助理研究員。台灣 台中市。
4 農委會農業試驗所生物技術組研究員兼組長。台灣 台中市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1111 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::228812 台灣農業研究　第71卷　第1期
另外即時反轉錄聚合酶連鎖反應 (real-time Real-time RT-PCR引子及探針的設計
RT-PCR) 方法也廣泛用在多種植物病毒檢測
Real-time RT-PCR引子是藉由Primer Ex-
(Mackay 2004)，惟目前尚缺利用real-time RT- pressTM (Applied Biosystems, San Francisco,
PCR於甜椒檢測PVY及PepMoV之方法。本
CA, USA) 軟體所設計，並由基龍米克斯生物
研究主要是利用 real-time RT-PCR 反應，以 科技股份有限公司 (台灣新北市) 所合成。引
PVY 和 PepMoV Nib 基因區域結合的專一性 子 (Potyvirus-Nib-350.1-F/R) 可專一性結合於
探針，檢測樣品是否帶有Potyvirus 屬病毒， Nib基因序列，產物大小為350 bp (如表1)。
探討此核酸檢測法之檢測專一性與靈敏度，並
使用由本試驗所設計 2組PVY及PepMoV專
達到可區分PepMoV和PVY的鑑別檢測效果， 一性探針，亦即採用Zheng et al. (2008) 使用
以建立real-time RT-PCR對此2種病毒之檢測 的Potyvirus-Nib-350.1-F/R通用引子對，並由
應用效益。 該引子對之增幅核酸區域分別設計PVY序列
探針及 PepMoV 序列探針，作為引子和探針
材料與方法 的設計區段，real-time RT-PCR螢光探針序列
是藉由Primer ExpressTM (Applied Biosystems,
病毒來源
San Francisco, CA, USA) 軟體所設計，並由
採集自南投縣之彩色甜椒，葉片呈現嵌紋
Biosearch Technologies Inc. (Petaluma, CA,
及植株矮化病徵等疑似病毒感染 (如 PVY 或 USA) 所合成。此專一性螢光探針 (PVY-Nib-
PepMoV) 者為試驗材料。取其葉片以10倍量 350.1-Probe、PEPMOV-Nib-350-Probe 如表 1
(w/v) 磷酸鉀緩衝液 (0.01 M KHPO4, pH 7.0) 所示) 是一段專一性結合於Nib基因序列。專
研磨後，經汁液接種於奎藜 (Chenopodium 一性探針5’和3’端分別標定FAM (6-carboxy
quinoa Willd.) 進行單斑分離 3次。取單一分 fluorescein excitation wavelength = 494 nm)
離株接種於煙草 (Nicotiana benthamiana) 植 螢光物質及BHQ1 (excitation wavelength = 534
物，作為本試驗接種源並將病葉組織置於50% nm) 吸收螢光物質。
甘油於-20℃長期保存。
RT-PCR和real-time RT-PCR方法
取罹病N. benthamiana作為接種源依前述
方法接種甜椒 (Capsicum annuum)，甜椒種植 所使用的RT-PCR分成RT及PCR二部分：
約一個月大，分別接種包括PVY和PepMoV， (1) 於 25 μL RT 反應中，首先加入 2 μg 甜椒
並種植於溫室進行病徵觀察觀察6 wk後採集 葉片全RNA、1 μL oligo-dT和random haxamer
葉片，經RT-PCR及核酸定序方法做確認。其 後混合，於70℃反應5 min後放入冰中；之後
他病毒分離株包括：potato virus X (PVX)、 於原反應管中分別加入5 μL之 5× first strand
tobacco mosaic virus (TMV)、tomato mosaic buffer (Promega, Madison, WI, USA)、5 μL 10
virus (ToMV)、cucumber mosaic virus (CMV) mM dNTP, 1 μL MMLV RT (200 U) (Prome-
和 pepper mild mottle virus (PMMoV) 等，為 ga)、1 μL Recombinant RNasin Ribonuclease
本所植物病理組病毒與細菌研究室收集與保存 Inhibitor (25 U) (Promega)，加無菌水補至 25
(Cheng et al. 2013)；所有供試病毒經接種於N. μL，反應時間為60 min 42℃。(2) 於PCR反應
benthamiana後作為接種源供後續試驗用。 中，分別加入2.5 μL之10× buffer (Protech, Tai-
pei, Taiwan)、0.5 μL之10 mM dNTP、各0.5 μL
植株全RNA的抽取純化 之0.1 μM Potyvirus-Nib-350.1-F/R引子、2 μL的
取0.1 g新鮮甜椒葉片，置於液態氮中研磨， 全RNA模板、以ddH O補至25 μL。PCR反
2
並參照市售試劑組 (Trizol Reagent, Invitrogen, 應條件為95℃/5 min、30個循環的95℃/30 s、
Carlsbad, CA, USA) 的操作手冊抽取甜椒葉片 55℃/30 s和72℃/30 s，72℃/5 min和16℃定溫。
全 RNA，抽取完成的全 RNA 保存於-80℃， Real-time RT-PCR所使用的藥劑為KAPA
待後續試驗使用。 PROBE FAST qPCR Kit (Kapa Biosystem,
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1122 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::2288Potyvirus分子檢測技術 13
表1.　本試驗所使用之引子與核酸探針。
Table 1.　Nucleotide sequences of primers and TaqMan probes used in this study.
Primer/probe Sequence (5’-3’) Product (bp) Tm (℃) Reference
Primers
Potyvirus-Nib-350.1 (F) GTGTGTGTWGATGAYYTCAAYAA 350 45 Zheng et al. (2008)
Potyvirus-Nib-350.1 (R) TCYACAACGGTRGAAGGTTGMCC 350 60 Zheng et al. (2008)
TaqMan probes
PVY-Nib-350.1-Probe Quasar 670-TGGTTGGGATAAATTG This study
CTTCGGCGTC-BHQ-2z
PEPMOV-Nib-350-Probe CAL Fluor Orange 560-CATTCCA This study
ACCGTCCAACAACATTCA-BHQ-1y
z GenBank Accession no. AB711155.1 (potato virus Y genomic RNA, nearly complete genome).
y GenBank Accession no. NC_001517.1 (pepper mottle virus, complete genome).
Wilmington, MA, USA)，在 20 μL 的反應體 GAY YTC AAY AA-3’) 和 Potyvirus-Nib-350.1
積中，加入的反應物分別為：KAPA PROBE (R) (5’-TCY ACA ACG GTR GAA GGT TGM
FAST qPCR Master Mix (2×) 10 μL、0.1 μM CC-3’) 引子進行 PCR 反應，反應條件為：
Potyvirus-Nib-350.1-F/R引子各2 μL、0.5 μM 95℃/3 min、40個循環的95℃/30 s、55℃/30 s
PVY-Nib-350.1-Probe探針、0.5 μM PepMoV- 和72℃/30 s，72℃/5 min和16℃定溫，檢測試
Nib-350.1-Probe探針、ROX Low (50×) 0.4 μL、 驗則使用全RNA (1 ng μL-1) 為模版經RT轉為
KAPA RT Mix (50×) 0.4 μL、2 μL的cDNA模 cDNA 後進行 10× 系列稀釋 (估算 RNA 濃度
板 (等比例混合之PVY和 PepMoV cDNA)、以 由1 ng μL-1至10-7 ng μL-1) 的方式，取各稀釋
ddH2O補至20 μL。反應條件為：95℃/3 min， 液進行 RT-PCR 以及 real-time RT-PCR 反應。
40個循環的95℃/15 s、60℃/1 min。Real-time 另外使用罹染PVY和PepMoV的甜椒植株全
RT-PCR 反應偵測機器為 ABI PRISM® 7500 RNA做檢測；分別將其全RNA以10×系列稀
Sequence Detection System (Applied Biosyste- 釋 (10 ng μL-1至0.1 ag μL-1) 的方式，分別取用
ms, San Francisco, CA, USA)。
罹染PVY或PepMoV的全RNA，另混合相同
RT-PCR和real-time RT-PCR的專一性 濃度 (10 ng μL-1) 之PVY和PepMoV全RNA進
測定 行靈敏度試驗，分別進行RT-PCR及real-time
RT-PCR反應，其反應物及條件如前述。
為測定所設計的引子和探針序列是否對
PepMoV 和 PVY 序列具專一性，以健康甜椒 評估以 real-time RT-PCR 檢測 PVY 和
植株葉片和感染不同病毒之煙草葉片組織包括 PepMoV的效率
TMV、ToMV、PMMoV、CMV和PVX，抽取
核酸增幅效率確認包括一系列稀釋以確定
煙草全RNA進行RT-PCR及real-time RT-PCR
多重反應中PVY和PepMoV引子/探針組合的
反應，其反應物及條件如前述。
擴增效率。將同時含有PVY和PepMoV的總
檢測PVY和PepMoV的靈敏度試驗 量RNA稀釋至10 ng μL-1，並使用10×系列稀
為測定所設計的探針應用於本研究之real- 釋至1 × 10-5 ng μL-1。Real-time RT-PCR擴增
time PCR對檢測PVY和PepMoV病毒的靈敏 時，針對總量RNA濃度繪製每種稀釋液的cy-
度，本研究使用罹染病毒之植物組織的全RNA cle threshold (Ct) 值。Ct 值大於 35 的稀釋液
進行靈敏度試驗。Potyvirus Nib基因檢測：將 不包括在結果中。使用增幅效率Ex = 10(-1/slope)
PVY和PepMoV所感染的甜椒病株全RNA， 從圖的斜率計算放大效率 (Ex) (Rasmussen
以 PVY-Nib-350.1-F (5’-GTG TGT GTW GAT 2001)。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1133 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::228814 台灣農業研究　第71卷　第1期
結果
0.13 (A)
0.12
Real-time RT-PCR對PVY和PepMoV的 0.11
0.10
專一性測定 0.09
0.08
0.07
為確定上述所設計的引子和探針在檢測
0.06
PVY或PepMoV樣品的試驗中是否具專一性， 0.05
0.04
以 real-time RT-PCR 方法，分別與 PVY 感染 0.03
0.02
甜椒植株、PepMoV感染甜椒植株、健康的甜 0.01
0.00
椒、健康的煙草、PVX 感染甜椒植株、CMV -0.01
感染甜椒植株、TMV感染甜椒植株 ToMV和
感染甜椒植株的全RNA與no template control 0.250 (B)
0.225
(NTC) 對照組進行 real-time RT-PCR 反應， 0.200
結果顯示添加兩組探針進行試驗：PVY 感染 0.175
0.150
n
甜椒之組織具陽性反應 (如圖 1A)，Ct 值為 R 0.125
∆
0.100
25.9，而對於其他甜椒病毒如 CMV、TMV、
0.075
ToMV 和 PVX 及健康的甜椒，與作為負對照 0.050
0.025
組之無菌水皆無反應，PepMoV感染甜椒之組 0.000
織具正反應 (如圖1B)，Ct值為28.9，而對於
其他甜椒病毒如CMV、TMV、ToMV和PVX 0.325 (C) Amplifi cation Plot
0.300
及健康的甜椒，與作為負對照組之無菌水皆無 0.275
0.250
反應，另外混合 PVY 和 PepMoV 病毒 RNA 00..222050
0.175
亦可同時檢測 (如圖1C) 經由上述試驗顯示， 0.150
0.125
所設計的引子和探針於real-time RT-PCR方法 0.100
0.075
試驗皆對 PVY、PepMoV 病毒基因片段具有 00..005205
0.000
專一性。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Cycle
RT-PCR和Real-time RT-PCR對檢測PVY
和PepMoV的靈敏度試驗 圖1.　Real-time RT-PCR檢測PVY和PepMoV的專
一性試驗。專一性受試材料顯示與PVY或PepMoV
探討RT-PCR和real-time RT-PCR對於檢
測PVY、PepMoV的靈敏度，針對罹染PVY及 反應不與PVX、TMV、ToMV、CMV和PMMoV
PepMoV的甜椒全RNA檢測之。結果顯示以 反應：(A) PVY 病毒檢測；(B) PepMoV 病毒檢測；(C)
RT-PCR方法檢測PVY、PepMoV之靈敏度可至 PVY + PepMoV病毒檢測。
10-1 ng (圖 2)；相同樣品以 real-time RT-PCR
Fig. 1.　Specificity of real-time reverse transcrip-
方法檢測，靈敏度可至10-3 ng (圖3)。上述結
tion-polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection
果顯示，在檢測 PVY、PepMoV 靈敏度上，
of potato virus Y (PVY) and pepper mottle virus (Pep-
real-time RT-PCR方法高於RT-PCR 100×。將
MoV). The specific test of real-time RT-PCR showed
上述real-time RT-PCR結果繪製成標準曲線圖
that it reacts with PVY or PepMoV and does not react
(圖 4)：設定縱座標為 Ct 值，橫坐標為 Poty-
with potato virus X (PVX), tobacco mosaic virus
virus-Nib-350 RNA量，則可獲得PepMoV標 (TMV), tomato mosaic virus (ToMV), cucumber mosa-
準曲線圖為R2 = 0.991 (E = 96.59%)，PVY標 ic virus (CMV) and pepper mild mottle virus (PMMoV).
準曲線圖為 R2 = 0.994 (E = 103.24%)，本試 (A) PVY detection only; (B) PepMoV detecion only;
驗結果可應用於定量病毒含量。 and (C) analysis for PVY + PepMoV.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1144 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::2299Potyvirus分子檢測技術 15
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
39
38 PepMov
37
Slope = -3.406
36
35 R2 = 0.991
34
350 bp 33 E = 96.59%
T
C32
31 PVY
30
Slope = -3.246
圖2. 　RT-PCR法進行靈敏度試驗檢測PVY及 29
PepMoV之電泳圖結果。混合PVY及PepMoV全 28 R2 = 0.994
RNA之10×系列稀釋液 (1–10-7 ng) 為模板。行M： 27 E = 103.24%
26
100 bp核酸分子標準液；行1–8 分別為1–10-7 ng之
25
核酸稀釋液；行9：NTC。 0.00001 0.0001 0.001 0.002 0.01 0.02 0.1 0.2 1 2 3 4 5 10
Quantity
Fig. 2.　Sensitivity detection of reverse transcrip-
tion-polymerase chain reaction (RT-PCR) for both po- 圖4.　Real-time RT-PCR法檢測經系列稀釋之PVY
tato virus Y (PVY) and pepper mottle virus (PepMoV). + PepMoV其反應結果的標準曲線。計算其增加濃
Mixed with PVY and PepMoV, 10× serial dilutions of 度與斜率之關係；10×系列稀釋之PVY和PepMoV
total RNA as templates (1–10-7 ng). Lane M: 100 bp
marker; lanes 1–8: 1–10-7 ng total RNA diluent; and 全RNA (1–10-7 ng)。
lane 9: no template control (NTC). Fig. 4.　Real-time reverse transcription-polymerase
chain reaction (RT-PCR) slope calculation for potato
virus Y (PVY) and pepper mottle virus (PepMoV) using
the cycle threshold (Ct) slope method with increasing
Amplifi cation Plot
0.325 concentrations of total RNA positive for both PVY and
0.300 PepMoV. The standard curve of real-time RT-PCR ex-
0.275 periment results; PVY and PepMoV full RNA (1–10-7
0.250 ng) in 10× serial dilutions.
0.225 PVY
0.200
n0.175 A B C D
∆R0.150 分別為35.7和37.7。發現 PVY的線性斜率為
0.125 A
0.100 PMV B -3.246，PepMoV 的線性斜率為 -3.406。PVY
0.075
0.050 C 和PepMoV的擴增效率的計算分別為103.24%
00..002050 D 和96.59% (如圖 4)。
E,F,G,H
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Cycle
討論
圖3.　Real-time RT-PCR法進行靈敏度試驗檢測PVY
+ PepMoV。縱軸：∆Rn值；水平軸：Ct值；10× 由於田間生態相多樣性而發生多重病毒混
系列稀釋之PVY + PepMoV全RNA (A–H：分別表示
合感染的情形十分普遍，已有許多多重病毒檢
1–10-7 ng)。
測的研究發展以因應此現況。例如：使用 RT-
Fig. 3.　Sensitivity of real-time reverse transcrip-
tion-polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection PCR 同時檢測 PVX、 PVY、potato leaf roll
of potato virus Y (PVY) and pepper mottle virus (Pep-
virus (PLRV)、和 potato virus S等5種馬鈴薯
MoV). Vertical axis: ∆Rn value; horizontal axis: cycle
threshold (Ct) value; total RNA of PVY + PepMoV (A– 病毒 (Du et al. 2006)；使用免疫磁珠法同時檢
H: 1–10-7 ng, respectively) by 10× serial dilutions.
測馬鈴薯病毒PVY、PVX和PLRV (Bergervoet
et al. 2008)；RT-PCR 鑑定 PVY 和 PLRV 等
評估以real-time RT-PCR同時檢測甜椒
2種馬鈴薯病毒 (Klerks et al. 2001)；RT-PCR
上PVY和PepMoV的效率 檢測TMV、CMV、tomato spotted wilt virus
PVY + PepMoV的陽性檢出之RNA濃度 (TSWV)、tomato chlorosis virus (ToCV)、
均為1 × 10-3 ng μL-1，PVY和PepMoV的Ct值 PVY和PVX等6種番茄病毒 (Liu et al. 2019)。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1155 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::330016 台灣農業研究　第71卷　第1期
RT-PCR同時檢測甜椒CMV、TMV、PMMoV、 和PVY抗血清無法區分 PepMoV和PVY此2
PVY 和 TSWV 等 5 種病毒 (Nemes & Salánki 種病毒。本研究使用Potyvirus病毒Nib基因，
2020)。甜椒在台灣常採用露天或設施栽培， 針對病毒特異區序列設計出PVY 及 PepMoV
為連續採果作物，且栽培過程需持續摘除側 專一性探針，並可鑑定此2種病毒。而本研究
芽，推測可能去芽或採果時，或透過刀具汙 利用 PepMoV、PYV RNA 方式進行 real-time
染病毒而容易造成病毒傳播。此外，藉由蟲 PCR試驗，結果顯示檢測靈敏度可至10-3 ng，
媒傳播的速度甚快，病毒病已成為台灣茄科 並建立 PVY 及 PepMoV 病毒標準曲線。RT-
作物栽培區常發生的病害之一。目前使用簡 PCR檢測法之靈敏度可至 10-1 ng，本研究結
併式引子對 (degenerate primer) 進行RT-PCR 果顯示在檢測 PVY 和 PepMoV 靈敏度上，
方法可用於鑑定 Potyvirus病毒屬，已被使用 real-time RT-PCR方法高於RT-PCR 100×。此
於茄科病毒檢測 (Gibbs & Mackenzie 1997; 靈敏度在全RNA之結果稍低，推測可能與感
Chen & Adams 2001)。本研究使用通用引子對 染植物PepMoV RNA 含量之多寡有關。經由
Potyvirus-Nib-350.1-F/R 以一般 RT-PCR 法檢 上述的試驗觀察到設計的引子和探針，不論是
測結果，顯示只對馬鈴薯Y屬病毒 (如PVY和 RT-PCR或是real-time RT-PCR可以應用於田
PepMoV) 產生350 bp產物，與其他Cucumo- 間樣品檢測。然而，本研究所設計的引子對屬
virus、Potexvirus、Tobamovirus、Carmovirus
於簡併式的通用引子對，應用於RT-PCR檢測
屬之受測病毒皆不反應 (結果未出示)，此序
時，具有廣效性檢測同屬不同病毒之效果，均
列來自於病毒Nib基因序列為高度保留區域，
已見諸於國內外報告；就本報告的技術研發上，
已知可偵測近 40 種 Potyvirus isolates，過去
以 multiplex RT-PCR 技術進行病毒檢測僅需
文獻報導使用 WCIEN 或 Potyvirus 之引子只
使用一對引子 (primer pair)，本試驗首次應用
能鑑定 50–80% 的 Potyvirus isolates；但仍有
於PepMoV和PVY之鑑定，具有操作便利及
少數 Potyvirus 因僅有外殼蛋白 (coat protein;
縮短個別病毒鑑定流程之優點；另外，此技術
CP) 基因的資訊，缺乏 Nib 之序列資料，故
亦說明可以在同屬病毒間序列十分相似的區域
無法以此基因進行鑑定 (Zheng et al. 2010)。
裡找出相異的序列，作為區分不同種的鑑別技
於real-time RT-PCR檢測結果顯示 (圖1)：使
術。由本研究結果顯示，real-time RT-PCR對
用 Potyvirus-Nib-350.1-F/R 引子組加上 PVY
於Potyvirus的檢出率高於RT-PCR，且由結果
與PepMoV探針組進行反應，亦僅對罹染PVY
推測real-time PCR法在低濃度之PYV感染植
或 PepMoV 之馬鈴薯 Y 屬病毒之甜椒植株
株中，仍具有可檢測出此病毒之優點，因此利
組織有反應，而對健康的甜椒和番茄、罹染
用real-time PCR法，將有助於作為田間病害
CMV、PVX、TMV、PMMoV 或 ToMV 的 甜
早期診斷之依據。
椒植株組織則均為陰性反應。經由上述兩個
試驗結果顯示，本研究所設計的 Potyvirus-
引用文獻
Nib-350.1-F/R 引子對以 RT-PCR 及 real-time
RT-PCR 方法檢測皆對 PVY 和 PepMoV 病毒
Abdalla, O. A., P. R. Desjardins, and J. A. Dodds. 1991.
基因片段具有專一性。 Identification, disease incidence, and distribution of
PVY 和 PepMoV 為常見危害茄科作物的 viruses infecting peppers in California. Plant Dis.
75:1019–1023. doi:10.1094/PD-75-1019
病毒者，在台灣過去的調查發現檢測樣本中，
Benner, C. P., C. W. Kuhn, J. W. Demski, J. W. Dobson,
PepMoV亦常伴隨與不同Potyvirus屬病毒複合
P. Colditz, and F. W. Nutter. 1985. Identification and
感染 (Cheng et al. 2013)。Cheng et al. (2013) incidence of pepper viruses in northeastern Georgia.
利用PepMoV-TW1的鞘蛋白製備多元抗血清。 Plant Dis. 69:999–1001.
此抗血清除與PepMoV具強烈反應，但發現與 Bergervoet, J. H., J. Peters, J. R. van Beckhoven, G. W.
台灣茄科作物常見之PVY仍有中強度血清反 van den Bovenkamp, J. W. Jacobson, and J. M. van
der Wolf. 2008. Multiplex microsphere immuno-de-
應，進行ELISA檢測時僅藉由光學吸光值之呈
tection of potato virus Y, X and PLRV. J. Virol. Meth-
色強度加以判別似乎不易區分。因此以PepMoV ods. 149:63–68. doi:10.1016/j.jviromet.2008.01.020
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1166 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::3300Potyvirus分子檢測技術 17
Chen, J. and M. J. Adams. 2001. A universal PCR primer doi:10.1016/s0166-0934(01)00258-0
to detect members of the Potyviridae and its use to
Kubota, K., T. Usugi, and S. Tsuda. 2011. Production
examine the taxonomic status of several members of
of antiserum and immuno- detection of Cucurbit
the family. Arch. Virol. 146:757–766. doi:10.1007/
chlorotic yellows virus, a novel whitefly-transmit-
s007050170144
ted crinivirus. J. Gen. Plant Pathol. 77:116–120.
Cheng, Y. H., R. Y. Wang, C. C. Chen, C. A. Chang, and doi:10.1007/s10327-010-0287-5
F. J. Jan. 2009. First report of Pepper veinal mottle
Lee, S. T. 1970. Studies on some naturally occurring
virus in tomato and pepper in Taiwan. Plant Dis.
strains of Potato virus Y in Taiwan. Plant Prot. Bull.
93:107. doi:10.1094/PDIS-93-1-0107A
12:41–50. (in Chinese)
Cheng, Y. H., T. C. Deng, C. C. Chen, J. Y. Liao, C. A.
Liu, H., K. Wu, W. Wu, W. Mi, X. Hao, and Y. Wu. 2019.
Chang, and C. H. Chiang. 2011. First report of Pep-
A multiplex reverse transcription PCR assay for
per mottle virus in bell pepper in Taiwan. Plant Dis.
simultaneous detection of six main RNA viruses
95:617. doi:10.1094/PDIS-10-10-0721
in tomato plants. J. Virol. Methods. 265:53–58.
Cheng, Y. H., T. C. Deng, C. C. Chen, C. P. Kuan, and C. doi:10.1016/j.jviromet.2018.12.011
A. Chang. 2013. Identification and occurrence of
Mackay, I. M. 2004. Real-time PCR in the microbiology
Pepper mottle virus isolated from peppers in Taiwan.
laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10:190–212.
J. Taiwan Agric. Res. 62:360–371. doi:10.6156/
doi:10.1111/j.1198-743x.2004.00722.x
JTAR/2013.06204.06 (in Chinese with English ab-
stract) Nemes, K. and K. Salánki. 2020. A multiplex RT-PCR
assay for the simultaneous detection of prevalent
Crosslin, J. M. 2012. PVY: An old enemy and a con-
viruses infecting pepper (Capsicum annuum L.). J.
tinuing challenge. Amer. J. Potato Res. 90:2–6.
Virol. Methods. 278:113838. doi:10.1016/j.jvirom-
doi:10.1007/s12230-012-9286-8
et.2020.113838
Dietzgen, R. G. and J. E. Thomas. 1991. Properties of vi-
Purcifull, D. E., T. A. Zitter, and E. Hiebert. 1975. Mor-
rus-like particles associated with banana bunchy top
phology, host range, and serological relationships of
disease in Hawaii, Indonesia and Tonga. Aust. Plant
pepper mottle virus. Phytopathology 65:559–562.
Pathol. 20:161–165. doi:10.1071/APP9910161
doi:10.1094/Phyto-65-559
Du, Z., J. Chen, and C. Hiruki. 2006. Optimization and
Quenouille, J., N. Vassilakos, and B. Moury. 2013. Potato vi-
application of a multiplex RT-PCR system for si-
rus Y: A major crop pathogen that has provided major
multaneous detection of five potato viruses using
insights into the evolution of viral pathogenicity. Mol.
18S rRNA as an internal control. Plant Dis. 90:185–
Plant Pathol. 14:439–452. doi:10.1111/mpp.12024
189. doi:10.1094/PD-90-0185
Rasmussen, R. 2001. Quantification on the LightCycler.
Gibbs, A. and A. Mackenzie. 1997. A primer pair for
p.21–34. in: Rapid Cycle Real-Time PCR: Methods
amplifying part of the genome of all potyvirids by
and Applications (Meuer, S., C. Wittwer, and K. I.
RT-PCR. J. Virol. Methods 63:9–16. doi:10.1016/
Nakagawara, eds.) Springer. Heidelberg, Germany.
S0166-0934(96)02103-9
408 pp.
Gyoutoku, Y., S. Okazaki, A. Furuta, T. Etoh, M. Mizobe, K.
Kuno, S. Hayashida, and M. Okuda. 2009. Chlorotic Scholthof, K. B. G., S. Adkins, H. Czosnek, P. Palukai-
yellows disease of melon caused by Cucurbit chlorot- tis, E. Jacquot, T. Hohn, B. Hohn, K. Saunders,
ic yellows virus a new crinivirus. Jpn. J. Phytopathol. T. Candresse, P. Ahlquist, C. Hemenway, and G.
75:109–111. doi:10.3186/jjphytopath.75.109 D. Foster. 2011. Top 10 plant viruses in molecular
plant pathology. Mol. Plant Pathol. 12:938–954.
Han, J. H., H. S. Choi, D. H. Kim, H. R. Lee, and B. D.
doi:10.1111/j.1364-3703.2011.00752.x
Kim. 2006. Biological, physical and cytological
properties of pepper mottle virus-SNU1 and its RT- Shukla, D. D., C. W. Ward, and A. A. Brunt. 1994. The Poty-
PCR detection. Plant Pathol. J. 22:155–160. viridae. CAB International. Wallingford, CT. 516 pp.
Kim, M. S., M. J. Kim, J. S. Hong, J. K. Choi, and K. Zheng, L., P. J. Wayper, A. J. Gibbs, M. Fourment, B.
H. Ryu. 2009. Patterns in disease progress and the C. Rodoni, and M. J. Gibbs. 2008. Accumulating
influence of single and multiple viral infections on variation at conserved sites in potyvirus genomes is
pepper (Capsicum annuum L.) growth. Eur. J. Plant driven by species discovery and affects degenerate
Pathol. 127:53–61. doi:10.1007/s10658-009-9570-8 primer design. PLoS ONE 3:e1586. doi:10.1371/
journal.pone.0001586
Klerks, M. M., G. O. Leone, M. Verbeek, J. F. van den
Heuvel, and C. D. Schoen. 2001. Development of Zheng, L. B., C. Rodonibc, M. J. Gibbsab, and A. J.
a multiplex AmpliDet RNA for the simultaneous Gibbsd. 2010. A novel pair of universal primers for
detection of Potato leafroll virus and Potato virus the detection of potyviruses. Plant Pathol. 59:211–
Y in potato tubers. J. Virol. Methods. 93:115–125. 220. doi:10.1111/j.1365-3059.2009.02201.x
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1177 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::330018 台灣農業研究　第71卷　第1期
Development of Real-Time Reverse Transcription-
Polymerase Chain Reaction to Identify and Detect
Potato Virus Y and Pepper Mottle Virus in
Sweet Pepper
Cheng-Ping Kuan1,*, Ying-Huey Cheng2, Chia-Hsin Tsai3, Ching-Shan Tseng1, and Tso-Chi Yang4
Abstract
Kuan, C. P., Y. H. Cheng, C. H. Tsai, C. S. Tseng, and T. C. Yang. 2022. Development of
real-time reverse transcription-polymerase chain reaction to identify and detect potato virus
Y and pepper mottle virus in sweet pepper. J. Taiwan Agric. Res. 71(1):11–18.
The real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was, for the
first, developed to identify and differentiate potato virus Y and pepper mottle virus in sweet pepper.
The results showed that this nucleic acid amplification technology can simultaneously detect both
potato virus Y and pepper mottle virus. No amplification was obtained from other Solanaceae viruses
and healthy plants. The method can be used to identify single or multiple infections. The results in-
dicated that this quantitative RT-PCR has the advantages of good specificity and high sensitivity. The
technology will be applied to assess field surveillance for sweet pepper.
Key words: Potato virus Y, Pepper mottle virus, Detection, Real-time RT-PCR.
Received: April 14, 2021; Accepted: October 12, 2021.
* Corresponding author, e-mail: pcr123@tari.gov.tw
1 Associate Research Fellows, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
2 Associate Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
3 Assistance Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
4 Research Fellow and Division Director, Biotechnology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan,
ROC.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0022 關關政政平平..iinndddd 1188 22002222//33//2211 上上午午 1100::0055::3300