國際種子檢查協會(ISTA)發展近況與未來趨勢(摘錄-種子健康檢查) - 農業知識入口網

 陸、種子健康檢查

種子健康委員會的任務係負責開發及出版經驗證的種子健康檢查程序並促進這些檢查方法應用在國際種子貿易的流通。種子健康委員會由來自14個國家的14位委員組成，每一位委員均有其擔任的角色負責指定任務。委員會轄下有兩個附屬委員會個別負責方法驗證、品質管理、熟練度測試及四個工作小組(包含真菌、細菌、病毒與線蟲)的編制。在2010~2012年的年會與大會中，關於種子健康檢查的重要議題包含有：規則修訂、新方法的介紹、種子健康手冊的修訂、種傳病害名彙之編輯、種子健康檢查樣本大小的調查結果、熟練度測試結果、實驗室比對測試結果等。
（一）規則修訂：自2012年2月2日起ISTA有針對協會發布的數個檢查方法進行修訂或修正，例如豌豆早褐病毒(Pea Early Browning virus)與豌豆種傳嵌紋病毒(Pea Early Browning virus)檢查方法中的180 µl修改為100 µl (7-024)、十字花科黑腐病菌的檢查方法中滅菌釜設定壓力修正為15 psi (7-019)等細節。其中檢測亞麻種子之Botrytis cinerea(灰黴病菌)、Alternaria linicola、Colletotrichum lini(炭疽病菌)等三種方法修訂整合為同一方法，本修正計畫係由SNES先進行預備試驗，試驗內容包含有培養溫度、培養光照及培養時間等三個條件的調整，再加上培養基中Streptomycin的濃度差異，經設定好各項條件要求且預備試驗結果無顯著差異後，進行實驗室比對；檢查樣品中每一病原菌汙染的情形各分為健康、低度汙染與中度汙染，每個設定條件的試驗樣本分四重複、各為400顆種子，5個測試的內容如下：1)麥芽糖瓊酯培養基不加Streptomycin，20°C、黑暗培養；2)麥芽糖瓊酯培養基加Streptomycin (50 mg/L)，20°C、9天黑暗以及12H NUV(近可見紫外光、波長300~400 nm)/12H黑暗；3)麥芽糖瓊酯培養基不加Streptomycin，22°C、12H NUV/12H黑暗；4)馬鈴薯葡萄糖瓊酯培養基加Streptomycin (50 mg/L)，20°C、9天黑暗以及NUV；5)馬鈴薯葡萄糖瓊酯培養基加Streptomycin (50 mg/L)、20°C、12H黑暗/12H光照；評估日數為第5、7、9天。最後確定針對三個病原菌的檢測方法條件為麥芽糖瓊酯培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊酯培養基(含Streptomycin 50 mg/L)，20°C、9天黑暗以及12H NUV(假如需要培養至產孢)，調查日數為第5、7、9天。
（二）新方法的介紹：ISTA將於2013年1月1日起針對數個種子健康檢查方法發布新版本，其中包含利用滲透壓法進行大麥網斑病(net blotch，由Pyrenophora teres引起)及條斑病(strip blotch，由Pyrenophora graminea引起)之偵測(7-027)；以不同的麥芽抽出物溶液改善向日葵種子灰黴病菌(Botrytis cinerea) 之偵測(7-003)；應用Bio-PCR進行胡蘿蔔細菌性葉枯病菌(Xanthomonas hortorum pv.carotae )之偵測(7-020)；番茄與番椒之菸草嵌紋病毒屬(Tobamovirus)之偵測，藉由分析菸草上的局部病徵作為指示以偵測感染番茄與番椒的菸草嵌紋病毒屬(7-028；如圖1)；在現行的十字花科黑腐病菌的偵測方法中增加聚合酵素鏈鎖反應(PCR)的選項(7-019；如圖2、3)。於2011年年會中特別介紹了偵測大麥網斑病及條斑病之滲透壓法與大麥散黑穗病菌胚萃取流程：兩個方法的發明人均為Gösta Joelson(1924-1995)，檢測大麥網斑病菌及條斑病菌之滲透壓法於1983年在渥太華首次發表，本法將種子放在一開放式的盆子中於90°C下預處理2小時，在一浸過糖液的濾紙上壓製出凹洞，以真空抽氣管將種子放入凹洞中培養於烘箱內，攜帶病原菌的種子會在濾紙上留下淡淡的色素痕跡，再滴加稀氫氧化鈉溶液會使色素呈現明顯紫色，以放大鏡觀察並記錄，但是模糊痕跡則不予記錄；而檢測大麥散黑穗病菌胚萃取流程內容為，將準備好的種子放入燒杯中加入硫酸，接著於75°C下培養50分鐘後移除脫掉的麥殼並確認未失掉任何一顆種子，將脫殼後的種子移至裝有氫氧化鈉與氯化鈉混合溶液的三角燒瓶中，經培養一晚後攪拌溶液至見到所有的胚向上浮起，將胚收集到燒杯中，使用4mm、2mm與1mm的網篩疊起後種子過篩，再用清水將篩出的胚洗淨後以濾網收集，加入乳酸培養一夜，隔日再以酒精清洗準備進行分析。另外還有一些新方法在進行測試中例如萵苣纈草(corn salad)上Acidovorax valerianellae之偵測；豌豆種子上Pseudomonas pisi pv.pisi 之偵測；十字花科黑腐病菌病原性檢測之生物性檢定的替代方法等。
（三）種子健康手冊的修訂：已完成種子健康手冊12章中的8章，目前寄送給種子健康檢查委員會進行校訂與修改建議中。
（四）種傳病害名彙之編輯：種傳病害名彙的編寫係一長期持續的計畫，內容以個別作物種類進行分群。
（五）種子健康檢查樣本大小的調查結果：本調查以問卷形式進行，調查結果顯示，個別檢查方法建議最小樣品大小為：7-001a、7-001b、7-002a、7-002b、7-016、7-017與7-018採用400顆種子；7-013a為2000~4000顆種子及1000個以上的胚；7-019與7-025為30000顆種子；7-020是10000顆種子；7-021與7-023是5000顆種子；7-024與7-026是2000顆種子。
（六）研習課程與研討會的舉辦：2010於法國(GEVES-SNES Angers France)舉辦種子健康檢查研習包含來自16個國家的21位人員參與，本次研習主要內容包含以鐮胞菌(Fusarium)與灰黴病菌(Botrytis)為對象的流行病學分類學及檢測方法；原定於敘利亞阿勒坡與西班牙阿爾梅莉亞舉辦之種子健康研習及研討會均告延期；2014年的種子健康檢查研討會預定於蘇格蘭愛丁堡舉辦。
（七）其他：熟練度測試(Proficiency test, PT)辦理項目包括有大麥散黑穗病、十字花科黑腐病與大豆莢枯病等；實驗室比對測試(comparative test, CT) 項目則為菜豆暈環葉燒病菌(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)之病原性測試(傷口接種試驗)為主(7-021)。PT與CT測試結果由法國Valerie Grima ult 進行統計分析。菠菜種傳病原真菌的比較試驗將與華盛頓州立大學的Lindsey du Toit合作進行；番茄種子上的細菌性潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)檢測將與EPPO合作進行。
以下以生物檢定法(Bioassay)檢測番茄種傳菸草嵌紋病毒屬(Tobamoviruses) 之感染力為例說明：
菸草嵌紋病毒(Tobacco mosaic virus；簡稱TMV) 及番茄嵌紋病毒  (Tomato mosaic virus；簡稱ToMV) 是番茄常見之種子傳播病毒病害，亦可經機械傳播。(Lewandowski and Dawson 1998; Hadaset al., 2004, Huttinga and Rast 1995; Demski 1981)
酵素連結抗體免疫測定法(ELISA)廣被應用於病毒檢測，但無法區別病毒粒子是否具感染力，因此易產生偽正反應(false positive results )(Mauryet al., 1987; Nolan and Campbell 1984)。為克服此問題國際蔬菜種子健康倡議(the International Seed Health Initiative for Vegetables, ISF (簡稱ISHI-Veg))籌組一個多實驗室之局部病斑比較實驗，係將番茄種子萃取物，以機械摩擦接種方式，接種至抗病菸草品種上(Holmes 1929; Hadas 1999; Hadaset al., 2004)，例如Nicotiana tabacum “Xanthi NN‟(Stangeet al., 2004; Diaz-Grifferoet al., 2006) 。接種葉片能對上述二種tobamovirus之感染造成過敏性反應，引發局部病斑形成(Ehrenfeld et al., 2008; Takahashi 1956; Erickson et al., 1999b; Whithman et al., 1994; Taliansky et al., 1994)。Hadas et al. (2004)報導以此法可從500粒健康種子次樣品中檢測出1粒病毒感染之種子，然ISHI 為增加比較試驗之靈敏度及確認可行性，改從250粒種子次樣品中檢出1粒帶病毒種子，惟此法尚無法區別TMV或ToMV。最低推薦樣品數為3,000粒種子。
對照材料為已知TMV/ToMV感染之種子、豌豆種子粉末混合感染TMV/ToMV/pepper mild mottle virus (PMMoV)之菸葉磨出物或TMV/ToMV/PMMoV-感染茄科寄主葉片之液狀萃取物。指示植物Nicotiana tabacum“Xanthi NN”需維持在至少12小時光照及20–25 °C環控溫室或生長箱內。此法之靈敏度因植株培養溫度過高或光線不足而顯著降低(Whithmanet al., 1994; Ordoget al., 2002; Dijkstraet al., 1977)，由其是高溫是關鍵因素，超過28°C時菸草之過敏性反應就無法表現(Samuel, 1931; Kiralyet al., 2008; Takahashi, 1975; Weststeijn, 1981;Padgettet al., 1997; Dawson, 1999)，因此夏季期間溫是高溫期，此法不夠靈敏不宜進行。最佳接種之菸草株齡為4-5片真葉期，太老或開花株嚴重降低病毒感染反應進而影響局部病斑數(Padmanabhanet al., 2008)，因此不宜使用；接種前1日植株澆水將可確保葉片細胞膨壓，利於接種工作。接種時戴塑膠手套或指套，輕柔一定施力下塗抹葉片避免傷害葉片，每一次樣品(subsamples)處理間須更新手套，同時以鹼性肥皂清洗手及指縫間再以清水去除殘留肥皂。其他注意事項尚有排除種子樣品間互相汙染，須在處理每樣品前後，進行70%酒精擦拭或噴灑消毒操作台面、生長箱、手等工作。