前言

       有鑑於馬鈴薯種薯品質之重要性，農委會防檢局在 98 年制定「馬鈴薯種薯病害驗證作業須知」，並匯集產官學界包括防檢局、中興大學、農業試驗所、臺中區改良場、臺南區改良場以及種苗場組成專家團隊到田間輔導，在團隊的通力合作下，從 G1 種薯就開始，連續繁殖世代 3-4 年的驗證把關。種苗場團隊在田間生產輔導觀察可知，田間不同品種對於晚疫病(Late blight)的抗感病不同，因此引發就本場近年收集之馬鈴薯材料進行抗晚疫病基因分析研究。

馬鈴薯晚疫病

       晚疫病由病原真菌Phytophthora infestans (Mont.) de Bary 所引起，是世界性的茄科作物重要病害，病原菌的菌絲或卵胞子殘存於馬鈴薯塊莖或番茄種子上，為本病害的首次感染源。在田間的二次感染傳播途徑主要藉由風雨飛濺或人畜攜帶，可於短時間內做長距離傳播。在台灣冬季低溫恰逢降雨，或是清晨低溫帶霧狀況，(16-22 ℃，相對濕度大於 90-95% ，維持 4-6 小時以上 )，病原菌菌絲會分化為孢囊柄與檸檬狀頂端有乳頭狀孢囊，並在12～15℃低溫刺激下，在受害組織上會產生大量的游走孢子，游走子能藉水膜游動。快速侵染植株，造成大面積的危害，被害部位呈水浸狀黑褐化，被感染部位以上的組織枯萎，嚴重時全株焦枯、死亡，嚴重時如火燒狀 ，造成馬鈴薯收成損失。因此健康種薯、抗（耐）病品種與田間衛生與病害管理為馬鈴薯晚疫病綜合管理之重要環節。

馬鈴薯抗（耐）晚疫病育種分子標誌

       抗（耐）病品種篩選，除了傳統抗病育種試驗外，在分子技術的快速發展下，導入分子標誌輔助選拔(marker-assisted selection, MAS)技術，檢測並篩選育種族群中帶有抗（耐）病的單株進行選拔。
針對晚疫病的抗病育種分子標誌的篩選，在同為茄科的野生醋栗番茄Solanum pimpinellifolium上已找到與晚疫病抗性有關的基因座，包括 Ph-1 、Ph-2 及 Ph-3 等，分別定位於第 7、10 和 9 號染色體上。而在馬鈴薯抗病基因研究上，在過去10年研究裡，目前許多馬鈴薯品種的抗病性是由S. demissum (2n = 6X = 72)、S. andigena Hawkes (2N = 4X = 48) 和其他野生種導入。在S. demissum上，已知共有11個R基因。而原產於墨西哥的二倍體馬鈴薯S. bulbocastanum (2n = 2x = 24)也找到部分抗晚疫病基因，如Rpi-blb1基因或稱RB基因，在高發病壓力的環境下也能表現其廣效性的抗性（broad spectrum resistance）。已知在不同的茄屬作物對於晚疫病菌的抗性上，有63個抗性相關基因，其中已在馬鈴薯基因圖譜定位並且經過選殖定序的超過25個，而這些抗病基因的構型皆具備白胺酸重複(leucine-rich repeat, LRR) 及核苷酸鍵結區（nucleotide binding site, NBS）。

抗病基因篩選流程

       使用之植物材料主要為種苗場收集之馬鈴薯品種（系），經由組織培養過程保存，確認無特定病原後，進行繼代保存。

       馬鈴薯組織培養材料使用DNA Kit抽取。所萃取DNA經核酸定量儀定量為25ng後，作為PCR反應之模板。所偵測抗病基因所用的引子對如，因其最適反應條件設置PCR步驟， PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離後判斷反應增幅條帶，並利用條帶有無的差異性進行抗感病分群。

接種試驗流程

       溫室內鑑定晚疫病抗性：選取馬鈴薯品種（系）組織培養材料，經發根培養及馴化後，定植於72格穴盤苗，經8週存活與發根健化後，進行晚疫病接種試驗，接種用的晚疫病菌株(菌株代號為214006與215024)為農業試驗所的安寶貞博士分離保存之菌株（交配型 A-1）。

       選出的品系種植至第三片葉長出，並在接種前種植在霧氣室內。接種後保持 100%的相對濕度，與每日10小時光照與14小時黑暗，日夜溫設定為 25/20° C 間，游走子懸浮液配置濃度為 104 zoospores/ml，均勻噴灑至接種植株體。於感病對照組發病後，依據植株病徵表現，進行晚疫病罹病程度的判定，結果如圖四。

結果討論

       由試驗結果可知，樣品1號在28種受檢標記中，有24種呈現陽性反應；而另一抗(耐)晚疫病品種-樣品11號則有21種呈現陽性反應。但是在感(不耐)晚疫病品種-樣品10也有多達20種標記呈現抗性標記陽性反應，故推測已有許多抗性標記在臺灣的環境下已失去判別功能。因此，我們以上述三種在臺灣對晚疫病有明確抗感性的馬鈴薯，作來篩選出可能的抗性標記的樣態。

       挑出2種抗晚疫病品種及1種感病品種， 進行28種受檢標記的趨集性分析，若抗病品種在該種受檢標記結果為陽性(具備條帶)，同時感病品種在該種受檢標記結果為陰性(不具備條帶)，則表中呈現雙圈。由表四歸納出抗感病標記有四種，分別為Rpi-abpt (R2-F1/R2-R3)、R3 family (R3-Clade2-F/2,3-R)、Rpi-bt1 (Rpi-bt1-ps)，和Rpi-phu1 (OPB07+TG/GT)。此外，Rpi-blb2 (24L)在所有受檢測品種中皆成陽性反應，但在我們的實驗條件下，可看出其表現量在抗(樣品1號和樣品11號)、感(sample 10)品種間有明顯的差異，經重複驗證，結果一致。

       R3 family (R3-Clade2-F/2,3-R)僅出現於兩種已知的抗(耐)馬鈴薯品種sample 01和11上，因此可作為抗(耐)品種篩選的標記； 而Rpi-bt1 (Rpi-bt1-ps)和Rpi-phu1 (OPB07+TG/GT)則廣泛出現於供試馬鈴薯中，則不建議作為後續篩選之標地基因。在本次晚疫病接種試驗中，將所測試17種馬鈴薯品種（系）對於所接種的晚疫病菌感受性分作5大群(圖四)，僅有一品系呈現抗性表現，其他屬於敏感性及高敏感性。部分基因檢測具抗性之材料尚未進行接種試驗，仍待後續進行接種試驗結果。

未來展望

       生物個體對外界環境的具體表現的性狀，由基因直接或間接的操控著。隨著分子生物技術的演變，近代次世代基因解序，甚至是表觀基因體學(epigenetic )的新進展，提供品種判斷、園藝性狀選別、抗病育種篩選等各領域之運用。利用抗(感)病基因分子標誌分群及接種試驗上，可以得到印證。

       分子標誌運用在馬鈴薯抗病育種起始於1998年，針對抗馬鈴薯病毒Y(Potato Virus Y )為標的，檢定RYSC3基因標記。繼而開發馬鈴薯黃金線蟲(Globodera rostochiensis)、馬鈴薯包囊線蟲(Globodera pallida )、馬鈴薯病毒A(Potato Virus A )以及本篇所探討的晚疫病。馬鈴薯是全球第4大的糧食作物，運用廣泛，除了食用之外，還包括馬鈴薯加工食品、澱粉加工、畜牧飼料等，世界馬鈴薯的面積一直保持在2,000萬公頃，近10年來，生產區重心逐漸至歐美國家偏轉至亞洲及非洲國家，病蟲害相也隨著栽種區域氣候而改變，利用分子標的選育適當品種，也可加速選育流程。

註:朱映瑞先生為105/106年度分發至種苗改良繁殖場繁殖技術課服務於之替代役男，目前為清華大學醫學生物科技博士候選人，該員於本場服役期間，不吝分享其博士研究內容，不僅協助本課公共事務，更發揮其研究精神，時常與同仁討論研究內容，提供多樣的想法，擴展試驗研究的的廣度與深度。