茄科細菌性斑點檢測

摘要

      由Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria引起的細菌性斑點病是蕃茄與甜椒產區頗具威脅性的病害，該病原菌可殘存在作物殘渣、蕃茄自生苗、雜草、土壤、移植留及番茄及甜椒的種子等處。主要造成的病徵為斑點，主要造成的病徵為斑點，可發生於植株之莖，葉，葉柄，花軸，萼片，果實等部位。

      此病菌可依其對甜椒及蕃茄之致病力不同而區分為三個菌群，蕃茄菌群（Xcv T group ) ，甜椒菌群（Xcv P group) ，以及甜椒一蕃茄菌群（Xcv PT group)。 最近研究認為斑點病菌是一異質的族群，包括 A 群（病原菌歸屬於X. c. pv.Vesicatora，即X. axonopodis pv. vesicatoria）及 B 群（病原菌歸屬於 X.vesicatoria)）。

      目前可用於偵測斑點病菌的選擇性培養基為Tween B培養基及 CKTM 培養基。血清方法包括免疫螢光染色法（immunofluorescence staining)，及酵素連結抗體免疫法（ELISA ）。所發展的核酸偵測方法主要為聚合酵素連鎖反應（polymerase chain reaction PCR）技術，設計的專一性引子對 RST13 及 RST14 可針對Xcv 菌株產生 550bp 的片段，而專一性引子對 C-2-2L 及 C-2- 2 R 可針對 Xv 菌株產生 407 bp 的片斷，因此可應用此一組引子對進行斑點病菌之偵測。若應用專性引子對 RSTZ 及 RST3 可產生 840 bp的片段， RST9 及 RSTl0可產生 355 bp 的片段，但所產生之 PCR 產物需分別再進行內切限制酵素分析（restriction endonuclease analysis REA) ，則可確認所偵測細菌是否為斑點病菌。

      斑點病菌為洲植物保護組織列於A2的檢疫病原，依規定蕃茄及甜椒採種田皆不能有此病原菌，或所生產的種子均必須經過檢測，不得帶有本病原。根據歐盟檢疫規定蕃茄及甜椒種子生產區需謹防治以避免細菌性斑點病發生，並對所生產的種子進行偵測，需依循(1)種子萃取免疫螢光染色，(2)選擇性培養基分離(3)血清技術鑑定菌落(4)病原性測定確認菌株。

前言

      蕃茄、甜椒及辣椒等茄科作物是台灣重要的蔬果之一，栽培面積約 7721 公頃（農業統計年報 2003）。由Xanthomonas campestris pv. vesicatoria(Doidge) Dye 1978（或稱為X. axonopodis pv. vesicatoria Vauterin )引起的細菌性斑點病（(bacterial spot）是全世界蕃茄及甜椒頗具威脅陸的病害之一（許1959，許等 1990 , Gardner & Kendrick 1923 ' Jones et al. 1991 )，該病菌在自然界之寄主包括蕃茄，甜椒，辣椒，馬鈴薯，燈籠果及祕魯酸醬等，此病害尤好發生在溫暖朝濕的氣候下，不僅影響果實品質，嚴重時更造成重大的產量損失（許等 1990，Azaizeb & Bashan 1984 Gardner & Kendrick 1923 Goode & Sasser 1980 Hartman et al. 1990，Jones et al. 1991, Pohronezny & Volin1983) " 此病原菌可殘存於植物殘體、種子、 土壤、雜草及栘植苗等(Bashan et al. 1982 Gardner & Kendrick 1923 Jones et al. 1986 Sijam et al.1991) ，尤其藉由種子帶菌可造成長距離傳播(Bashan et al. 1982) ，再加上此病原菌對鏈黴素及銅劑其有抗藥性（吳等 1995 ，許 1989 ，許及徐 1991 , Marco & stall 1953Ritchie, & Dittapongpitch 1991)，因此防治相當不易。

       選用不帶細菌性斑點病菌之種子及田問衛生是防治茄科細菌性斑點病的主要方法((Leite et al. 1995) ，因此有關種子檢測技術極為重要” EPPO 將斑點病菌列為A2的檢疫有害生物(OEPP/EPPO 1988, OEPP/EPPO 1992)，並要求蕃茄及甜椒種子生產區不能有此病原菌，或所生產的種子必須經過檢測，證明不能帶有細菌性斑點病菌(OEPP/EPPO 1990)，方可越境運輸。本文茲就茄科細菌性斑點病之病徵及病原菌特性加以說明，並就應用培養基，血清及核酸等偵測技術之優點略述於下，以供相關施政之參考。

病徵

      茄科細菌性斑點病可發生於植株之莖，葉，葉柄，花軸，萼片及果實等部位。感染蕃茄時，初期為小的水浸狀斑，邊緣明顯，病斑略下陷，漸由黃色或淡綠色變褐色，最後壞疽時中央形成褐色或灰色，漸漸擴大成 2 - 5 mm不規則衫斑點。在果實上出現小的水浸狀黃色病斑，隨後轉為灰褐色瘡痂狀，中央下陷而外圍突起，病斑大小可從2 mm到10mm，有時周圍會有黃色暈環，病斑點通常很淺，但有時也能深人果壁。在蕃茄莖部，葉柄，花梗，萼片上罹病時均出現灰黑色，圓形到長圓形的淺斑（許1989）。

      感染甜椒時初期為圓形，淡綠色的小突起，另一面略凹陷，在老葉初為深綠色水浸狀斑點，通常病斑中央細胞崩解，在罹病數天後病斑繼續擴大，形成圓形或長圓形的淡黃或稻桿色的斑點，視寄主抗感病程度不同，病斑約介於 l -10mm 之間，具有水授狀的邊，最後變深褐色，有時病斑會連成不規則的大斑，最後整個葉片變黃，造成落葉。在莖部發病時呈現不顯著，細小，長方形，略凸起，中央為淡褐色的斑點，最後變組糙，但不會下陷。在果實上之病斑很顯著，圓形，學2-5mm，嚴重時幣個病斑破裂突起，造成果實表面變粗糙並呈疣狀，病斑初為淡綠，很快變為褐色（許1989）。

病原菌

      茄科細菌性斑點病菌（以下簡稱 Xcv）為革蘭氏陰性桿狀細菌，單極生鞭毛，可游動，為好氣性細菌，具有夾膜（capsule )，但不會形成內生孢子。在瓊指培養基上形成圓形，平滑，濕粘，具亮光，稍微凸起的黃色菌落，且菌落邊緣完整。此病菌可依其對甜椒及蕃茄之致病力不同而區分為三個菌（group)：第一群為蕃茄菌群（Xcv T group ) ，只對蕃茄上有致病力；第一群為甜椒菌群(Xcv P group) ，只對甜椒上有致病力；第三群為甜椒-蕃茄菌群（(Xcv PT group) ，於甜椒及蕃茄上均有致病力 ((Minsavage et al.1990）。

      其中感染蕃茄之菌株，可利用 Hawaii 7998 及 Hawaii 7981 蕃茄品系，分成三個生理小種(Jones & Stall 1998)。感染甜椒的菌株又可依其於不同甜椒品系Early Cal Wonder (ECW) ECW-10R ECW-20R ECW-30R上所形成的親和性反應再分7個甜椒生理小種(pepper races 0 race 6) (Bouzar et al. 1994 Cook & Stalie 1982 Kousik & Ritchie 1995 Minsavage et al. 1990 Sahin & Miller 1995)。台灣已發現二種蕃椒生理小種及才屯蕃茄生理小種（許 1989 ，許及徐 1990 , Hartman et al . 1990 )。

      近年來對於 Xcv 之變異性及歸類有更進一步的探討，依其生理、化學、血清及分子等特性可將 Xcv分為 A 群（ group A ）及 B 群（ group B ) （許 1998 , Jones 1993 , stall et al 1994 ）。 Louws 等人（ 1995 ）利用重複的基因序列（repetitive extragenic sequence REP ERIC and BOX）為引子，進行 PCR 反應（合稱 ep-PCR ) ，反應所得之基因指紋圖譜（fingerprint pattern）顯示 A 菌群菌株較具同質性，B 菌群菌株則具多樣性。

      許（許，1998）研究也認為台灣的斑點病菌也是一異質的族群，至少含有兩種遺傳性質不同的類群，其中之一 為 A 群，病原菌歸屬於X. c. pv. Vesicatoria，其特性為不具澱粉水解及果膠分解活性，在Biolog GN MicroPlate系統分析，細胞脂肪酸組成分析(15：0 ante-iso含量較低)，全細胞蛋白電泳圖譜，及染色體DNA相似系數等性質上有所差異，另一為B群，病原菌歸屬於X. vesicatoria。

      Vauterin等人(1995)依據DNA-DNA雜合及碳素源利用等之特性，將原Xanthomonas屬之植物病原細菌重新區分成20個種，其中Xcv之菌株中A群菌株則歸屬Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria ，而B菌群株則為Xanthomonas vesicatoria。Jones等(1993)由Xcv之一個A群菌株的染色體DNA中，選殖出一段與脂多醣類(lipopolysacchride)相關之抗原決定部位的DNA片段，設計出一組引子對(primer pairs)，RST13/RST14可使A群菌株產生550bp之條帶，而B群的菌株則不產生，將斑點病菌分為二群。呂研究(2003)發展出專一性引子對C-2-2L/2R針對 Xanthomonas vesicatoria產生407bp的DNA片段，而其他 Xanthomonas (包括A群)的菌株則不會產生。

      細菌性斑點病菌在27℃或30℃為最適生長溫度，可在作物殘渣，不同種類的雜草內或葉表、土壤、番茄自生苗，番茄及甜椒種子等處殘存。一般植物病原菌常是被動傳播的，如藉著風吹，雨水飛濺等方式傳播，也可藉由動物、人、昆蟲，蟎、農具、土壤粒子及水源等而傳播，又噴灌方式栽培有也利於細菌性斑點病菌在田間之傳播(Bashan et al. 1982 Gardner & Kendrick 1923 Jones et al. 1986 Sijam et al. 1991)。Basham等(Basham et al. 1982)認為種子是動要感染源來源，因為種子不但提供越冬場所，也可攜帶細菌性斑點病菌做長距離傳播。

選擇性培養基偵測

      應用選擇性培養基來偵測病原細菌，因為具有直接看到病原菌菌落的特性，因此在偵測上具有其重要性，但是相對的在空間、時間上也有較不經濟等缺點。McGuire 等(McGuire et al. 1986)研發生種半選擇性的培養基分別為Tween A， B及C，可從植物體內及土壤樣品中區分及鑑定斑點病菌，此三種培養基的選擇性是因為培養基中含有boric acid及各種抗生素，可降低雜菌污染率，但因為其避免污染的效率不完全，因此加入Tween80，因為脂肪酸被鈣沈澱，所以斑點病菌在這些培養基上培養約 3-7天後，會在黃色突起的菌落周圍出現一圈白色結晶狀的環，應用此三種培養基檢測佛州的細菌性斑點病菌株的回收效率分別為96%，88%及99%。其Tween B培養基較適合分離葉片上之斑點病菌。在 Sattler等所著＂種子及植物體細菌之偵測＂(1989)一書中，有關番茄上之斑點病菌之偵測即採用半選擇性培養基Tween B (McGuire & Jones 1989)，其流程如圖一，有關Tween B之配方如表一。

     Sijam 等( Sijam et al.1991) 於1991研發出半選擇性培養基 CKTM，此培養基可區分斑點病菌與其他的Xanthomonas campestris菌株，斑點病菌會在培養基上菌落周圍形成一圈透明的環，與Tween B培養基比較，其回收番茄種子上斑點病菌的效率為17.7- 100%，而 Tween B只有 6.3- 44.4%，且CKTM比 Tween B降低微生物污染的效率高，有關CKTM培養基之配方見表二(Sijam et al. 1991)。 1991年 Gitaitis等研發 CMC-E培養基，認為CMC-E比 Tween B培養基回收率高，且斑點病菌在 CMC-E培養基上會形成紫紅色的菌落並形成淺碟型的凹陷，只要具有纖維水解能力的X. spp.細菌即可在CMC-E上形成凹陷，是適合的鑑別培養基。

      但此培養基只對某此菌株具有高的回收率，對某些的回收率則不穩定，因此不適用於田間偵測。The International Seed Health Initiative for vegetables (ISHI-Veg)所編列有關＂Manual of Seed Health Testing Methods＂即應用培養基分離的方法來偵測番茄及甜椒種子上的細菌性斑點病菌，此方法主要提供種子工業參考，所採用的培養基包括Tween B及CKTM等。

血清偵測

      血清常被應用於植物病原細菌之偵測及鑑定(Hampton et al. 1990，Schaad et al. 2001)，當面對大量樣品時，血清提供一個可靠且花費少又容易操作的特點。已發展出的血清方法有很多種，如玻片凝聚法(slide agglutination)，免疫螢光染色法 (immunofluorescence staining)，酵性連結抗體免疫法(ELISA)等等。

      國外有一些學者從事斑點病菌血清之研發，包括多元及單元抗體，並改良血清方法以達偵測之效果。Jones 等(1997)將Indirect ELISA方法中萃取的緩衝液加以改良，加入lysozyme來取代傳統的磷酸緩衝液，可使偵測效能從107-108 cfu/ml提高到 106 cuf/ml，甚至可偵測到105 cfu/ml 的葉組織樣品。Veena & Vuurde (2002)發展免疫螢光菌落染色法(IFC immunofluorescence colony staining)，採用間接法 (indirect)來偵測番茄種子帶菌之情形，將血清連結螢光染劑(FITC, fluorescein isothiocyanate)，再以螢光顯微鏡觀察，此法可用於菌落之確認。 Tsuchiya & d'Ursel (2004) 針對斑點病菌的脂多醣體(LPS)發展三個單元抗體，應用三種ELISA 103-104 cuf/ml，且不論是人工接種之番茄及甜椒植株或田間樣品均可偵測到該病菌，可用於斑點病菌之偵測。

     EPPO應用血清方法來確認所分離之菌落是否為斑點病菌(OEPP/EPPO 1992)，其採用的血清方法包括玻片凝法(slide agglutination)，dot-ELISA (Lazarovits et al. 1987)，免疫螢光染色法(immunofluorescence staining, IF)等，所謂dot-ELISA方法主要是利用硝化纖維濾膜(nitrocellulose membrane, NCM)，再利用血清進行免疫結合反應，最後將濾膜置入基質反應中由其呈色判斷結果。

聚合酵素連鎖反應偵測

      聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction ，簡稱PCR)技術為目前最常被使用之核酸偵測技術，具有快速、專一且靈敏度高之優點(Mullis & Faloona 1987)且 PCR技術也廣泛應用於植物病原細菌之偵測上(Schaad et al. 2001)。

     最近核酸技術也被用於斑點病菌之分類、鑑定及偵測(呂2003，Jones 1993，Leite et al. 1994， Leite et al. 1995 Louws et al.1995， Obradovic et al. 2004)。Jones 等(1993)設計的引子對 (primer pairs) RST13 (5' TGG TTC CAG CCG TCC AGC AGG G 3')及 RST14 (5'CCC TAA AGG CAC TGG GCG TCG G 3')可使斑點病菌A群菌株產生 550bp之條帶，而B群的菌株則不產生。呂利用 RAPD技術 (2003)發展出專一性引子對C-2-2L ( 5' CAG CAA CAC GCT GAA ATC GTA G 3' )及 C-2-2R (5' TAG GGC GTC AGCTTG CAA TG 3' )可針對 Xanthomonas vesicatoria產生407bp的 DNA片段，而其他 Xanthomonas (包括 A群 )的菌株則不會產生，且偵測菌液的靈敏度可達1pg，呂(2003)指出若組合 Jones及呂研發之引子對，可直接應用於組織或種子上斑點病菌之偵測。

      Leite 等(Leite et al.1994，Leite et al. 1995)應用 PCR技術來偵測番茄及甜椒種子上的斑點病菌，應用與過敏性反應(HR)及病原性基因群有關的基因設計出的專一性引子對，再進行PCR反應。先取 2.5 g 的番茄種子(約一千粒種子 )或 10 g的小苗分別加入20ml或150ml的磷酸緩衝液，並以超音波震盪20 min，以無菌紗布過濾，所得之濾液經DNA萃取步驟，即可進行PCR反應，若應用引子對RST2 (5'AGG CCC TGG AAG GTG CCC TGG A 3') 及RST3 (5' ATCGCA CTG CGT ACC GCG CGC GA 3')則可產生 840 bp的片斷，若應用RST9 (5' GGC ACT ATG CAA TGA CTG 3')及 RST10 (5' AAT ACG CTGGAA CTG CTG 3') 則可產生355 bp的片斷，但因為不易與其他種的Xanthomonas 菌株區分，因此PCR產物分別再進行內切限制酵素分析(restriction endonuclease analysis ，REA)，來確認所偵測到的細菌是否為斑點病菌。在專一性方面，因為所使用的引子取自斑點病hrp區域的核苷酸序列，可以避開不具病產性的Xanthomonads干擾，不會與其它屬的病原菌反應，在偵測細菌性斑點病菌具有其專一性;在偵測甜椒及番茄種子的靈敏度為102-3 cfu/ml，比 ELISA方法的靈敏度高約一千倍，因此不用先將病組織增量或培養的步驟，可節省許多時間及物力。

結論

      一般植物病原細菌之檢測，可藉由長出試驗(growing out test)觀察病徵來判斷，或直接至採種田進行病徵觀察檢測，或選擇性或半選擇性或鑑別性的培養基分離培養、或應用各種血清方法、或核酸分析等方法來偵測，整體而言，合併幾種方法一起使用來確認，較易準確度。

      對於茄科細菌性斑點病菌之檢測，歐洲植物保護組織規範係依循(1)種子萃取免疫螢光染色，(2)選擇性培養基分離，(3)血清鑑定所分離的菌落，(4)病原性測定確認菌株(OEPP/EPPO 1992)，其流程如圖二。

      不論選擇何種方法來偵測，各有其優點，如核酸方法雖然應用廣，具有靈敏及快速的優點，是目前發展的所有偵測方法中靈敏度最高的方法，但是其偵測效率常受樣品中的抑制物質干擾，而血清方法其靈敏度比核酸方法低，但面對大量樣品此二種方法都是不錯的選擇 ，但此二種方法其缺點為無法看到菌落也無法區分活的或死的細胞，且可能因為偽陽性反應，使一批種子被廢棄，而造成業者成本增加，另外也由於需要設備及適當的人力資源而增加成本;反觀傳統的偵測方法，如培養基及病原性測定不但簡單、方便、易操作，且具有不需設備及特別的人力資源等優點，其缺點則是相對的靈敏度較低，比較耗時，且費勞力又占空間。

      茄科細菌性斑點病在台灣發生超過17年，過去多著重病原生理、生理小種、生態及抗藥性等田間相關研究(吳等 1995，許 1989，許及徐 1991，許等1990, Hartman et al. 1990)，近幾年在斑點病菌分群及偵測上之研究有不錯的結果，許(1998)的研究確認台灣的斑點病也分為 A及B二群，而呂(2003)針對屬於 B群的斑點病菌應用 RAPD方法發展出專一性的引子對，可應用於偵測。未來除前述工作外，亦應參考歐盟之做法，在防檢疫技術及行政上建立所謂檢疫有害生物之偵測組織架構，以強化我農業競爭力，提昇種子品質。

資料來源：蔬菜種子病害檢測技術