十字花科黑腐病菌之檢測

黃秀珍、黃德昌、徐世典

摘要

      由Xanthomonas campestris pv. Campestris所引起的十字花科蔬菜黑腐病是屬於世界性病害，在台灣也是影響蔬菜產量及種子品質之重要因子。此病原菌可殘存於種子，成為最初感染源，得到健康種子是主要防治及維持種子生產品質之最主要策略，因此此病菌之檢測是確保種子健康的基石。目前研發用於檢測的技術必須符合精確、快速及操作簡易條件。在本文中將對幾種偵測技術討論其利敝。

前言

      十字花科蔬菜黑腐病(Black rot)屬於世界性之病害，尤其普遍發生於熱帶及亞熱地區。台灣當然也不例外，也是嚴重發病區域，連高冷地區栽培的蔬菜亦可受害。此病害之病原是Xanthomonas campestris pv. Campestris(中文俗稱十字花科黑病菌，在此簡稱Xcc)。

      Xcc屬革蘭氏陰性菌，屬好氣菌，具有單極生鞭毛。本菌可藉由葉緣水孔侵入，因此常見病徵為自葉緣向內形成V字型之黃褐病斑，其周圍有黃暈，感染部位的葉脈會變黑，黃褐色部分乾枯而破裂。因本病屬於系統性病害，在適當環境下，Xcc由葉脈之維管束向上及向下蔓延。Xcc可殘存於種子上，遭受污染或感染的種子，菌量過高可引起苗期之damping off，並成為最初惑染源，極可能造成病害之重大發生。

      在美國South Caroline州，曾被調查當種子帶有Xcc比動超過0.01%時，黑腐病極可能普遍發生。Xcc亦可藉由雨水飛濺或灌溉(高灌)傳播，有時在風雨過後，會在葉片上出現散佈式之點狀病斑。除此之外Xcc尚可雜草根圈土壤以低量殘存，或在植物殘體亦有利於其存活。

      藉由健康種子的生產，埶行種子的檢疫以確定獲得無菌種子，或適當的種子處理，這些為防治本病害最主要策略。而這些措施則端賴於有良好的病菌偵測技術。

本病害之診斷

      十字花科黑腐病的診斷可由作物植於田間時所出現病微進行初步的推測診斷，將罹植株樣本帶回實驗室後，經顯微鏡鏡檢確定為細菌性病害，再經病組織分離技術，利用NA或PDA培養基進行分離組織純化，於30℃培養72小時後，挑取黃色、平滑圓形之菌落，或可利用半選擇性培養基SM(Schaad et al.,1980)、SMA(黃與徐,1987)進行偵測分離，必要時可再進一步以相關的生理生化測試或Biolog快速鑑定系統以進行確認診斷。

種子帶菌之檢測

      先進國家對於種子的健康極重視，以十字花科黑腐病及菜豆黃暈葉枯病(由Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola惑染)為例，用於種苗的種子，帶菌容許率均為0，美國並特別成立一委員會名為Nc-135，專門統籌十字花科蔬菜種子帶細菌的防治研究與技術推廣，顯見得到健康乾淨的種子是關系種原產業的經濟效益，而種子防檢疫是確保種子健康的必須措施，因此選擇精確有效率的病菌偵測與鑑定技術則是種子防檢疫的基本考量。

      最早被用於偵測帶細菌者為種法(grown-on)，此法可顯示種子傳病的比率，但其測試過程易受環境及生物因子干擾，而且費時耗人力，所需空間大;植物接種法(grown-on)，此法可顯示種子傳病的比率，但其測試過程易受環境及生物因子干擾，而且費時耗人力，所需空間大;植物接種法(Sando,et al.,1980)，則是將種子磨出液注射入寄主植物而後觀察病徵的發展，這個方法不易定量細菌，病徵也會因雜菌的存在或環境因子的不同而變化，影響結果的判定。因此這些傳統檢定方法目前已經較少被採用。

      應用噬菌體(phage)於檢測種子帶菌亦曾被考慮，噬菌體溶斑法雖然簡單、快速，但得到病原細菌撌一性高的噬菌體不易獲得，且當種子攜帶太多雜菌時，以此法偵測標的細菌，靈敏度不高。以血清學方法檢測種子帶菌情形(Alvarez et al.,1985),能測出的菌量通常只在104-105cells/ml間，對於某些需達到近乎帶菌零容忍率而言，其靈敏度非常不理想。

      直接分離偵測法是將種十帶病菌萃取出來後，直接在一般、鑑別性(Differential)或選擇性培養基上分離培養，必要時，獲得的菌落可進一步利用植物接種、核酸雜合或簡單生理生化測式予以確認。這個方法的優點是操作簡便，誤判的機率低，而且可以估算種子的帶菌量，但這方法必須有適當的萃取方法及培養基配合。

      黃等人(黃、徐,1987a,b)將未經任何處狂的十字花科蔬菜種子，浸漬於含tween 80的磷酸緩衝生理食鹽水中，強力震盪洗滌分離，即可回收到最多量的種帶黑腐病菌，洗出液還可以進一步沉澱，以增進偵測的靈敏度。繼而配合改良SM(schadd,et al.,2001)培養基SMA進行分離，可測出0.01%的帶菌種子，石等人(Shih et al.,2000)曾找到具專一性的DNA探針，以菌落雜合法確認上述的描述方法所分離得到的Xcc的菌落。

      近年來因生物技術快速發展，以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)方法檢測種帶病菌之可行性已成為研發偵測鑑定的方法的主流，此法可提高靈感度，在台灣曾國欽博士及鄧文玲博士也正在研發中，期望能對十字花科蔬菜種子Xcc的情況有所幫助。

結論

      黃(1988)曾以直接分離法偵測台灣生產的青花菜、甘藍、花椰菜、結球白菜及芥藍種子，結果在測試中的177批種子中，發現17.5%帶Xcc，帶菌種子平均帶菌量為每公克2.1×103個細胞，顯示我國所生產蔬菜種子帶菌的普遍性，恐將影響出口種子的品質。因此敏感、專一性、簡便、速效及低成本等的偵測技術試種子防檢疫上不可或缺的工具，也可對國產種子或進口種子品質把關。

參考文獻

1. 黃德昌.1998.台灣十字花科黑腐病防治研究近況.蔬菜品種改良研討會.29-43頁.台東區農業改良場。
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3. 黃德昌、徐世典.1987b.利用選擇性培養基由台灣十字花科蔬菜種子及土壤中偵測黑腐病菌之技術.植保會刊29：217-231.
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資料來源：蔬菜種子病害檢測技術 研討會專輯