小花蕙蘭細斑病菌 Fusarium proliferatum 之 生長與寄主侵染特性.pdf - 農業知識入口網

台灣農業研究 (J. Taiwan Agric. Res.) 71(1):35–47 (2022) 研究報告
DOI:10.6156/JTAR.202203_71(1).0004
小花蕙蘭細斑病菌 Fusarium proliferatum 之
生長與寄主侵染特性
黃巧雯1,*　黃晉興2　謝廷芳3
摘要
黃巧雯、黃晉興、謝廷芳。2022。小花蕙蘭細斑病菌Fusarium proliferatum之生長與寄主
侵染特性。台灣農業研究71(1):35–47。
細斑病 (fleck spot) 為小花蕙蘭栽培過程中重要葉部病害之一，主要危害幼葉，在幼葉上產生細小黑褐
色圓形或不規則形病斑，有時病斑周圍產生淡黃色暈環，雖然葉片被病原菌感染後其病斑不會繼續擴大，但
葉片具有斑點不美觀而影響植株的商品價值，偶而會造成葉片基部腐敗而死亡。由病組織所分離到真菌，
依據形態特徵及核醣體內轉錄區間與translation elongation factor 1 alpha (TEF-1α) 基因的核酸序列比對鑑定
為Fusarium proliferatum，並完成柯霍氏法則證明本菌對小花蕙蘭具有病原性。本病原菌最適菌絲生長與孢
子發芽溫度分別為24−28℃與20−32℃。小花蕙蘭葉細斑病菌分離株 (F. proliferatum Fp-172) 可在四季蘭、報
歲蘭及春蘭等品種嫩葉上造成細小褐色斑點，但在成熟葉片上則不造成病斑。另將此菌株的孢子懸浮液 (106
spores mL-1) 噴施接種於四季蘭不同齡期幼芽葉片上，經28 d後，苗齡0.5、1.0、1.5、2.5、3.5及4.5 mo的
幼芽罹病度分別為58.3−59.3%、52.8−62.5%、29.2−49.3%、13.9−25.9%、2.8−14.6%及0%，成熟葉片則無病
斑產生。由細斑病菌易於感染1.5 mo內齡期幼芽的結果，可作為未來擬定葉細斑病防治時程之參考依據。
關鍵詞：小花蕙蘭、細斑病、細斑病菌。
前言 美都有零星出口，近年來中國逐漸成為另一
個重要市場。目前台灣小花蕙蘭栽種面積約
小花蕙蘭俗稱國蘭 (Chinese cymbidium)，
70–100 ha，栽種地區以台中、南投、雲林、
是由蕙蘭屬 (Genus Cymbidium) 的四季蘭 (或稱
嘉義、高雄及屏東等中南部為主，多數以雙層
建蘭) (C. ensifolium)、報歲蘭 (C. sinense)、
遮陰網室栽培，其中栽培品種依序為四季蘭
春蘭 (C. goeringii)、寒蘭 (C. kanran) 及九華 (53%)、報歲蘭 (36%)、春蘭 (6%) 及其他小花
蘭 (C. faberi) 等植物所組合成複合族群的統 蕙蘭 (5%) 等 (Hung et al. 2010; Lin 2015)。
稱，其原生地分布在中國、台灣、韓國及日本
小花蕙蘭為地生蘭，主要由葉片 (leaf)、
等地區，又稱東洋蘭；這類植株株型、花型較 假球莖 (pseudobulb)、鞘葉 (sheath leaf) 及肥
小，與大花型的虎頭蘭或稱大花蕙蘭具區別 大的根 (root) 組成，慣行栽培以分芽繁殖為
性，又稱為小花蕙蘭 (oriental cymbidium)， 主 (Du Puy & Cribb 2007; Hsu 2010)。小花蕙
其繁殖各自以組培苗及分株為主 (Hung et al. 蘭生育緩慢且幼年性長，假球莖的側芽長出新
2017)。台灣小花蕙蘭多以外銷為主，70–80% 芽，發育成叢生狀的植株。由田間觀察發現，
以上銷往韓國，其他國家如日本、香港及北 嫩葉外觀上淺綠色、葉質柔軟又光滑細緻，逐
投稿日期：2021 年8月11日；接受日期：2021 年10月15日。
* 通訊作者：cwhuang@tari.gov.tw
1 農委會農業試驗所植物病理組助理研究員。台灣 台中市。
2 農委會農業試驗所植物病理組副研究員。台灣 台中市。
3 農委會農業試驗所植物病理組研究員兼組長。台灣 台中市。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 3355 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::003336 台灣農業研究　第71卷　第1期
漸長大成成熟葉時其外觀上轉深綠色、葉質硬 本病主要危害初生芽之葉片，初期在葉背
厚且葉面較粗糙。四季蘭從新芽萌發至發育成 上產生細小黑褐色圓形或不規則形病斑，有時
熟約 5–6 mo；報歲蘭新芽萌發至成熟需約 8 病斑周圍產生淡黃色暈環，不久後病斑逐漸呈
mo (Hung et al. 2010)。於栽培農友術語中小 現褐化壞疽，病斑不再繼續擴大，有時嚴重時
花蕙蘭之不同齡期芽 (shoot age)，以植株成熟 導致幼芽褐化枯萎死亡，而小花蕙蘭是以芽計
葉片 (10分) 之相對應長度比例區分為幾分芽 價，若新芽、幼葉無法健康生長，則嚴重影響
幼葉齡期，此時期與本研究觀察四季蘭剛冒新 植株的商品價值。目前雖已知F. proliferatum
芽時期約為新芽生長 2 wk時間；當新芽生長 為引起小花蕙蘭葉細斑病之主要病原菌，然其
1 mo時間相對於 1−2 分芽幼葉齡期；新芽生 在田間之發生生態仍未明，另外，觀察園區葉
長到 1.5 mo 時間相對於 2−3 分芽；當新芽生 細斑病發生情形，發現病徵容易出現在幼芽葉
長長度到成熟植株一半時為5分芽，需2.5 mo 片上，隨著幼芽越成熟其病徵越不易表現，為
時間；當新芽生長到8分芽時需3.5 mo時間； 釐清小花蕙蘭葉細斑病病原特性與發生生態，
當新芽生長成成熟葉時則需要4−5 mo時間。 本研究進行病原菌形態觀察、生理特性及病原
四季蘭一年可完成1−2個生長週期。 性分析外，另探討F. proliferatum感染小花蕙
台灣迄今正式記載之小花蕙蘭主要病害 蘭之不同齡期葉片之難易度，作為未來防治葉
有由Cymbidium mosaic virus (CyMV) 引起的 細斑病之參考依據。
蕙蘭嵌紋病、由 Odontoglossum rigspot virus
(ORSV) 引起的齒舌蘭輪斑病；由Pectobacte- 材料與方法
rium carotovorum subsp. carotovorum 引起的
病原菌分離與保存
細菌性軟腐病、由 Burkholderia gladioli pv.
gladioli 引起的細菌性褐斑病；由 Phytoph- 將田間罹患細斑病病徵之罹病葉片攜回實
thora palmivora、P. parasitica 引起的疫病、 驗室，直接切取罹病葉片，以 0.5% (w/v) 次
由 Botrytis cinerea 引起的灰黴病、由 Colle- 氯酸鈉漂洗消毒30 s，繼而以 75% (v/v) 酒精
totrichum gloeosporioides 引起的炭疽病、由 消毒30 s，最後再以無菌水漂洗 2次，自然風
Phyllosticta cymbidii 引起的葉斑病、由 Fu- 乾後，利用滅菌過之解剖刀切取病健部相鄰
sarium oxysporum 引起的基腐病或假球莖腐 組織置於2% (w/v) 水瓊脂培養基 (water agar;
敗病及由 F. proliferatum 引起的小花蕙蘭葉 WA) 上分離，將培養基置於室溫4–5 d，其分
細斑病；另外亦有葉芽線蟲 (Aphelenchoides 離所得之菌株置於potato dextrose agar (PDA;
besseyi, A. bicaudatus)、根瘤線蟲 (Meloido- Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 中純化後，
gyne incognita)、南方根腐線蟲 (Pratylenchus 待其產孢後進行單孢分離，並將其保存於PDA
coffeae) 引起的線蟲病害 (Hsu et al. 2002; Chen 斜面培養基及無菌水保存管中，並置於 10℃
et al. 2015; Wang et al. 2018; Huang et al. 保存備用。本研究使用之 Fp-165 及 Fp-172
2020)。其中由 F. proliferatum 引起的葉細斑 菌株為分別由南投縣魚池鄉及雲林縣莿桐鄉小
病 (fleck spot, leaf spot)，在台灣不僅危害蕙 花蕙蘭罹病葉片上所分離之菌株。
蘭、文心蘭、石斛蘭及嘉德麗雅蘭，亦為百合
接種源配製
苗枯病 (Wu & Huang 1997) 及孤挺花赤斑病
(Su et al. 2011) 主要病原菌；而國外則會造成 將由小花蕙蘭葉細斑病組織分離之F. pro-
圓錐石頭花冠腐病 (crown rot of gypsophila) liferatum Fp-172分離株培養於PDA斜面，置
(Lee et al. 2011)、紫苜蓿根腐病 (root rot of 於 25℃黑暗培養約 7 d 後，以無菌水將 PDA
alfalfa) (Cong et al. 2016)、萱草花腐病 (flow- 上所產生之孢子洗下，並利用血球計數器 (he-
er rot of daylily) (Li et al. 2018) 及糖松根腐病 macytometer, Bright-Line, Pomona, CA, USA)
(Fusarium root of sugar pine) (Stewart et al. 計算孢子濃度，再以無菌水製成孢子懸浮液
2016) 等。 (106 spores mL-1) 供接種試驗用。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 3366 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::0033小花蕙蘭葉細斑病 37
病原菌形態觀察與分子鑑定 溫度對病原菌菌絲生長與孢子發芽之影響
將所純化之病原菌菌株Fp-165與Fp-172 將 F. proliferatum Fp-165 及 Fp-172 菌株
培養於 PDA 培養基上，置於 24℃黑暗培養 分別於 PDA 培養基室溫培養 7 d 後，以直徑
約 7 d 後觀察菌落形態；後再將本病原菌置 0.5 cm 滅菌過之打孔器切取菌絲邊緣，置於
於 PDA 持續培養約 7 d 待其產孢，以滅菌之 PDA 平板中央，分別置於 4℃、8℃、12℃、
針頭挑取培養基上產孢之分生孢子，置於載玻
16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃及 40℃
片上，以光學顯微鏡 (Leica DM2500, Leica, 之定溫箱中黑暗培養，於培養後第8天測量其
Wetzlar, Germany) 觀察孢子形態與分生孢
菌絲生長之直徑，每個處理4重複，本試驗重
子梗構造，並以 NIS-Elements 4.51 版軟體
複進行2次。另外，F. proliferatum 之Fp-165
(Nikon, Tokyo, Japan) 測量50個以上分生孢子
及Fp-172菌株皆培養於PDA培養約8 d待其
大小。再參考Summerell et al. (2001) 及 Les-
產孢後，以無菌水配製約 200 spores 20 μL-1
lie et al. (2006) 所描述的鐮孢菌孢子著生方式
之孢子懸浮液，置於八孔載玻片上，並將玻片
與形態，鑑定所分離之鐮孢菌菌株。分子鑑定
保濕於玻璃培養皿中，分別靜置於4℃、8℃、
方式則是刮取菌絲置於微量離心管中，加入
12℃、16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃及
0.5 N NaOH溶液，將菌絲磨碎後，以28,500×
40℃之定溫箱中，24 h後取出於顯微鏡下觀察
g離心 (Heraeus Fresco 21 Microcentrifuge, Thermo
Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 5 min並 孢子發芽情形，每個處理4重複，本試驗重複
吸取上清液，與9倍體積之0.1 M Tris buffer 進行2次。
(pH 8.0) 混合，直接吸取混合後之溶液，以Taq 不同小花蕙蘭品種對葉細斑病之感病性
DNA Poly (Protech, Taipei, Taiwan) 聚合酶酵
供試小花蕙蘭品種計有報歲蘭 (Cymibium
素進行 DNA 聚合酶鏈鎖反應，分別增幅 in-
sinense)、春蘭 (C. goeringii)、「富山」四季
ternal transcribed spacer (ITS) (White et al.
1989) 與 translation elongation factor 1 alpha 蘭 (C. ensifolium ‘Fu-shan’)、「市長紅」四季
(TEF-1α) 基因片段 (O’Donnell et al.1998; Geiser 蘭 (C. ensifolium ‘Shih-jhang-hong’)、「彩虹」
et al. 2004)，增幅後產物委由源資國際生物科 四季蘭 (C. ensifolium ‘Tsai-hong’) 及「鐵骨素
技股份有限公司 (Tri-I Biotech Inc., New Taipei, 心」四季蘭 (C. ensifolium ‘Tie-gu-su-sin’) 等
Taiwan) 進行定序，定序後之序列再於National 6種不同小花蕙蘭品種品系。接種方式仿上述
Center for Biotechnology Information (NCBI) 病原性測定模式，將 F. proliferatum Fp-172
網站上所登錄之資料庫進行菌株序列分析比 菌株孢子懸浮液直接均勻噴霧於植株新芽部位
對，並將該序列登錄於NCBI基因資料庫。 (約 1 mo 內，1–2 分芽)，隨即以塑膠袋套袋
小花蕙蘭葉細斑病菌之病原性測定 進行保濕，並置於28℃定溫箱中，以無菌水作
為對照組，每種蘭花品種處理3重複，每重複
購買市售小花蕙蘭之報歲蘭、「富山」四
4株，每週觀察病徵進展情形，本試驗觀察至
季蘭、「彩虹」四季蘭及「鐵骨素心」四季蘭等
28 d止，本試驗重複進行2次。病害調查係計
品種植株。將 F. proliferatum Fp-172 菌株濃
算小花蕙蘭植株葉片 (由內而外) 上病斑數，並
度為106 spores mL-1孢子懸浮液以噴霧瓶均勻
將其分成5級，其中無病斑者為0級，葉片上
噴霧於小花蕙蘭新芽部位 (約1 mo內，1–2 分
芽)，每株約2 mL，隨即以塑膠袋套袋進行保 病斑數在1–10個病斑為1級，11–25 個病斑為
濕 (一直保濕到試驗結束)，並置於28℃定溫箱 2級，26–50 個病斑為3級，51 個以上或基部
中，持續觀察葉片上病徵進展及植株是否有基 褐化枯萎死亡現象為4級，再以下列公式求得
部褐化、植株枯死之情形。發病後，再由罹病 葉片的罹病度 (disease severity)：罹病度 (%) =
組織依上述組織分離法分離病原菌，以完成柯 [Σ(指數 × 該等級罹病葉數)/(4 × 總調查葉數)]
霍氏法則 (Koch’s postulates)。 × 100。
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 3377 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::003338 台灣農業研究　第71卷　第1期
四季蘭「彩虹」之不同齡期葉片對細斑病 平板於 25℃黑暗培養 7 d 後，菌落為白色略
之感病性 帶淡淡紫色、菌絲綿密生長 (圖2A)，利用滅
菌後之針頭沾取菌落後，透過光學顯微鏡可
將由小花蕙蘭葉細斑病病組織分離之 F.
觀察到分生孢子形態如圖 2B–E 所示，大孢
proliferatum 菌株 Fp-172 分離株培養於 PDA
子 (macroconidia) 為鐮刀形，無色，1–3個隔
培養基上，1 wk 後以無菌水將 PDA 上所產
膜，著生於分生孢子梗 (conidiophores) 之瓶
生之分生孢子洗下，並製成孢子懸浮液 (106
狀枝上，大孢子大小為17.9–41.0 μm × 3.8–2.1
spores mL-1) 供試驗葉片接種用。購買自南投
μm；小孢子 (microconidia) 呈棍棒狀，一
縣魚池鄉黃先生園區內之「彩虹」四季蘭 (C.
端扁平，無色，著生於分生孢子梗之瓶狀枝
ensifolium ‘Tsai hong’) 植株，本試驗選取 2
上，排列方式有假頭狀 (false heads) 或串生孢
wk (剛冒新芽)、1 mo (1–2分芽)、1.5 mo (2–3
子鏈 (chains)，小孢子大小為 5.8–11.6 μm ×
分芽)、2.5 mo (5分芽)、3.5 mo (8分芽) 及4–5
1.9–3.6 μm；無厚膜孢子 (chlamydospores) 產
mo (成熟葉，mature) 等 6種不同齡期葉片後，
生。為進一步進行菌株種的鑑定，將 Fp-165
將Fp-172分離株孢子懸浮液直接均勻噴佈於
及Fp-172分離株之ITS (accession No.分別為
葉片上，每株噴施約2–4 mL，接種後植株隨
MG871252 及MG871253) 序列及EF-1α基因
即以塑膠袋進行套袋保濕，並置於 28℃光照
部分序列 (accession No. 分別為MH153751及
12 h定溫箱中，記錄每株植株病害發生情形，
MH153750)，與 NCBI基因資料庫進行分析比
觀察至28 d止，對照組則以無菌水進行接種，
對，結果供試菌株與RS_79 isolate、Y. H. Yeh
每種處理3重複，每重複4株，試驗觀察28 d，
I0911 strain之ITS (MK332493與MK336501)
本試驗重複進行2次。依上述所示方法調查罹
與 WG 8406 B2C3、GuangD7 strain之EF-1α
病度。
(MH383509 與 KY85020) 之序列相似度高達
統計分析
100%。依據本病害之病徵表現、病原菌形態
各項處理之試驗資料利用 SAS 9.1 版統 特徵及分子鑑定結果，證明由葉細斑病罹病組
計分析軟體先進行變方分析 (analysis of vari- 織所分離之病原菌為F. proliferatum (Leslie et
ance; ANOVA)，再以最小顯著性差異 (least al. 2006; Wang et al. 2018)。
significant difference; LSD) 測驗在 5%顯著水
小花蕙蘭葉細斑病之病原性測定
準下，比較處理間平均值之差異。
為進一步瞭解F. proliferatum於不同小花
蕙蘭品種上之病原性，本研究將Fp-172 分離
結果
株之孢子懸浮液直接噴布於報歲蘭、「富山」四
小花蕙蘭葉細斑病之病徵 季蘭及「彩虹」四季蘭之嫩葉上，於接種10 d
本研究於種植四季蘭之「市長紅」、「彩 後，報歲蘭嫩葉開始出現黑褐色斑點病斑，隨
虹」、「富山」、「鐵骨素心」品系及報歲蘭品 著接種天數增加，葉片上黑褐色斑點數隨之增
種之小花蕙蘭園區陸續調查到葉細斑病發生， 加，於接種 30 d 後不僅有黑褐色斑點，且葉
細斑病主要危害初生芽之葉片，在嫩葉上產生 尖出現褐化枯萎現象 (圖3A)。而當接種於「富
直徑約2.3–8.7 mm之細小圓形或不規則形黑 山」四季蘭與「彩虹」四季蘭嫩葉上，則於接種
褐色病斑，病斑周圍產生淡黃色暈環，葉片被 7 d後開始出現黑褐色細小病斑，於接種14 d
病原菌感染後其病斑不再繼續擴大 (圖1)。 後葉片上黑褐色病斑更為明顯 (圖3B–C)；另
外，於接種 28 d 後，在「彩虹」四季蘭葉片上
小花蕙蘭葉細斑病菌之培養形態與分子
不僅有黑褐色斑點病徵，且葉片地基部黑褐化
鑑定
枯萎、葉片褐化後易抽起 (圖3D)，之後再進
小花蕙蘭葉細斑病菌經單孢培養於 PDA 行罹病組織分離，結果顯示所得菌株與接種病
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 3388 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::0033小花蕙蘭葉細斑病 39
(A) (B) (C) (D) (E)
圖1.　小花蕙蘭細斑病在葉片上病徵。(A) 「市長紅」四季蘭；(B) 「彩虹」四季蘭；(C) 「富山」四季蘭；(D) 「鐵
骨素心」四季蘭；(E) 報歲蘭。
Fig. 1.　Fleck spot symptoms of oriental cymbidium. Small spots with yellowish halo appeared on leaves of (A)
Cymbidium ensifolium‘Shih-jhang-hong’ cultivar; (B) C. ensifolium‘Tsai-hong’ cultivar; (C) C. ensifolium‘Fu-shan’
cultivar; (D) C. ensifolium‘Tieh-gu-su-sin’ cultivar; and (E) C. sinense.
(A) (B) (C)
(D) (E)
圖2.　小花蕙蘭葉細斑病菌之形態特徵。(A) 小花蕙蘭葉細斑病菌於PDA培養基上於25℃培養 7 d後的菌落
形態；(B) 小孢子呈鏈生狀排列；(C) 小孢子呈假頭狀排列；(D) 大孢子；(E) 小孢子。標尺 = 10 μm。
Fig. 2.　Morphology of Fusarium proliferatum. (A) colony pattern of F. proliferatum cultured on potato dextrose
agar (PDA) at 25℃ for 7 d; (B) microconidia produced in short chains; (C) microconidia produced in false heads; (D)
morphology of macroconidia; and (E) microconidia. Bar = 10 μm.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 3399 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::006640 台灣農業研究　第71卷　第1期
(A) (B) (C) (D) (E)
圖3.　小花蕙蘭葉細斑病病原菌 (Fusarium proliferatum Fp-172) 分別接種於 (A) 報歲蘭；(B) 「富山」四季蘭；
(C、D) 「彩虹」四季蘭葉片上之病徵表現，以 (E) 無菌水接種於「彩虹」四季蘭為對照組。
Fig. 3.　Symptoms of fl eck spot disease of oriental cymbidium appeared on leaves after artifi cial inoculation with
conidial suspenseion of Fusarium proliferatum Fp-172. (A) Fleck spot on leaves of Cymbidium sinense; (B) C. ensi-
folium‘Fu-shan’ cultivar; (C) C. ensifolium‘Tsai-hong’ cultivar; (D) basal leaves brown rot on C. ensifolium‘Tsai-
hong’ cultivar; and (E) healthy leaves of C. ensifolium‘Tsai-hong’ cultivar without artifi cial inoculation.
原菌菌株，其形態特徵皆相同，完成柯霍氏法 生長直徑則僅有1.0 cm，而 4℃及40℃培養時
則，證實F. proliferatum對報歲蘭與四季蘭具 病原菌幾乎不生長。另外，溫度對本菌孢子發
有病原性。 芽之影響結果則如圖 5 所示，Fp-165 菌株而
言，其於24–32℃時，發芽率可達91%以上，
溫度對病原菌菌絲生長與孢子發芽之影
為最適孢子發芽之溫度。Fp-172 菌株，則以
響
24–28℃為最適發芽溫度，其發芽率可達96%
小花蕙蘭葉細斑病菌菌絲塊培養於不同溫 以上，兩菌株在8℃以下及40℃時，孢子完全
度之培養箱中，其生長結果如圖 4 所示，於 不發芽。
24℃培養時，病原之生長最為快速，於培養後
不同小花蕙蘭品種對葉細斑病之感病性
8 d 時 Fp-165 及 Fp-172 之平均生長直徑分別
為 8.4 cm與 8.2 cm；於 28℃培養時其平均生 選取報歲蘭 (C. sinense)、春蘭 (C. go-
長直徑為 7.9 cm，而於 20℃及32℃培養時其平 eringii)、「富山」四季蘭 (C. ensifolium ‘Fu-
均生長直徑皆約為 5.5 cm，於 16℃培養時其 shan’)、「市長紅」四季蘭 (C. ensifolium ‘Shih-
平均生長直徑約為4.3 cm，於 12℃培養時其平 jhang-hong’)、「彩虹」四季蘭 (C. ensifolium
均生長直徑約為3.1 cm，於 8℃培養時其平均 ‘Tsai-hong’) 及「鐵骨素心」四季蘭 (C. ensifo-
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4400 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::0088小花蕙蘭葉細斑病 41
)
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C
Temperature (°C)
圖4.　溫度對Fusarium proliferatum Fp-165及Fp-172分離株菌絲生長之影響 (在PDA平板培養8 d)。
Fig. 4.　Effect of temperature on mycelial growth of Fusarium proliferatum Fp-165 and Fp-172 isolates cultured on
potato dextrose agar (PDA) plates for 8 days.
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Temperature (°C)
圖5.　溫度對Fusarium proliferatum Fp-165及Fp-172分離株孢子發芽之影響。
Fig. 5.　Effect of temperature on spore germination of Fusarium proliferatum Fp-165 and Fp-172 isolates.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4411 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::009942 台灣農業研究　第71卷　第1期
lium ‘Tie-gu-su-sin’) 等 6 種不同小花蕙蘭品 (2–3分芽)、2.5 mo (5分芽)、3.5 mo (8分芽)
種，分別接種 F. proliferatum Fp-172 菌株孢 及 4.5 mo (成熟葉，mature) 共 6 種程度齡期
子懸浮液於植株新芽部位 (約1 mo內，1–2 分 葉片，分別接種 F. proliferatum Fp-172 菌株
芽)，於接種12 wk 後，結果如表 1所示，第1 孢子懸浮液，於接種4 wk後，結果如表2所
次試驗中，以「富山」四季蘭之罹病度為72.9% 示，由第1次及第2次試驗結果中，幼葉從剛
最高，其次為「彩虹」四季蘭、「鐵骨素心」
四季蘭、「市長紅」四季蘭，罹病度分別為 表2.　「彩虹」四季蘭之不同齡期葉片對細斑病之感
70.0%、61.1%、60.0%，罹病度最低則為春蘭 病性。
9.4%；第 2次試驗中，仍是以「富山」四季蘭 Table 2.　Effect of shoot age on susceptibility of fleck
spot disease of Cymbidium ensifolium ‘Tsai-hong’
之罹病度為 66.1%最高，其次為「市長紅」四
inoculated with Fusarium proliferatum Fp-172 isolate
季蘭、「鐵骨素心」四季蘭、「彩虹」四季蘭， for 4 wk.
罹病度分別為 62.1%、47.2%、44.5%，罹病 Disease severity (%)z
度最低則仍為春蘭 8.4%，與對照未處理間具 Shoot age (months) Experiment 1 Experiment 2
有顯著性差異 (P < 0.05)。此外，在病害調查 0.5 58.3 ay 59.3 a
時發現成熟株 (苗齡超過1年) 的葉片雖有接 1.0 52.8 a 62.5 a
種供試菌的分生孢子，但皆未出現任何細斑病 1.5 49.3 a 29.2 b
的病徵。 2.5 13.9 b 25.9 b
3.5 2.8 b 14.6 bc
四季蘭「彩虹」之不同齡期葉片對細斑病
4.5 0.0 b 0.0 c
之感病性
LSD 28.1 15.0
由不同小花蕙蘭品種對葉細斑病之感病性 z The disease severity was recorded using a 0–4 rating index
as follows: 0 = no symptoms, 1= fleck spot number 1–10, 2 =
試驗結果得知，「彩虹」四季蘭品種之罹病度
fleck spot number 11–25, 3 = fleck spot number 26–50, and
高，且為目前主要栽種品種之一，因此本研究 4 = > 51 of fleck spot number or necrotic to death of basal
leaves. Disease severity (%) = [(N × 0 + N × 1 + N × 2 +
挑選「彩虹」四季蘭品種 (C. ensifolium ‘Tsai- N × 3 + N × 4)/N × 4] × 100. 0 1 2
3 4
hong’) 為試驗材料，幼葉齡期 (新芽齡期) 分 y Means within a column followed by the same letter are not
significantly different at 5% by least significant difference
為2 wk (剛冒新芽)、1 mo (1–2分芽)、1.5 mo (LSD) test.
表1.　不同小花蕙蘭品種對葉細斑病之感病性。
Table 1.　Susceptibility of fleck spot disease of different oriental cymbidium cultivars inoculated with Fusarium pro-
liferatum Fp-172 isolate for 4 wk.
Disease severity (%)z
Cultivation Experiment 1 Experiment 2
Cymbidium sinense 37.5 by 33.3 c
C. goeringii 9.4 c 8.4 d
C. ensifolium ‘Fu-shan’ 72.9 a 66.1 a
C. ensifolium ‘Shih-jhang-hong’ 60.0 ab 62.1 a
C. ensifolium ‘Tsai-hong’ 70.0 a 44.5 b
C. ensifolium ‘Tie-gu-su-sin’ 61.1 a 47.2 b
CK 0.0 c 0.0 e
LSD 23.5 7.9
z The disease severity was recorded using a 0–4 rating index as follows: 0 = no symptoms, 1= fleck spot number 1–10, 2 = fleck spot
number 11–25, 3 = fleck spot number 26–50, and 4 = > 51 of fleck spot number or necrotic to death of basal leaves. Disease severi-
ty (%) = [(N × 0 + N × 1 + N × 2 + N × 3 + N × 4)/N × 4] × 100.
0 1 2 3 4
y Means within a column followed by the same letter are not significantly different at 5% by least significant difference (LSD) test.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4422 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::0099小花蕙蘭葉細斑病 43
冒新芽 2 wk 至 1 mo (1–2 分芽) 齡期其細斑 央呈空心狀，最後使葉片變形而失去商品價
病罹病度高達52%以上，其次為1.5 mo (2–3 值 (Broadhurst 1996; Ichikawa & Aoki 2000;
分芽) 齡期其細斑病罹病度分別為 49.3% 及 Aoki et al. 2001; Ichikawa 2004; Han et al.
29.2%；當幼葉生長到 2.5 mo (5分芽) 齡期則 2015; Ruan et al. 2021)，與本研究由 F. pro-
分別為 13.9% 及 25.9%；當幼葉到 3.5 mo (8 liferatum 引起葉片黑褐色斑點病徵有差異，
分芽) 齡期其細斑病罹病度降至15%以下，當 然而 F. fractiflexum 與 F. subglutinans 目前在
幼葉轉成成熟葉片 (4–5 mo) 則細斑病皆不發 台灣無任何紀錄可引起蘭科作物病害 (Wang et
生。 al. 2018)，這部分仍有待未來進一步釐清。
鐮孢菌屬 (Genus Fusarium) 為一大群的
討論 菌絲狀真菌，歸屬於叢赤殼科 (Family Nec-
triaceae)，廣泛分布於果園、苗圃、溫室及田
小花蕙蘭俗稱國蘭，為蕙蘭屬 (Cymbid-
間，可在任何土壤中殘存好幾年。鐮孢菌屬
ium) 蘭科植物，是台灣主要經濟栽種的蘭花
(Fusarium sp.) 在自然界扮演多重角色，有些
之一。台灣小花蕙蘭是以外銷為主的產業，每
菌株以腐生性 (saprophytes) 方式殘存於土壤
年外銷產值約1千萬美元，其中植株是以芽計
中，有些菌株以內寄生 (endophytic) 方式存
價。本研究由田間病害調查得知，細斑病為小
於植物體內，有些則是以致病性 (pathogenic)
花蕙蘭於幼葉時期重要病害之一，在嫩葉上產
方式感染植株任何部位，產生頸腐 (crown)、
生細小黑褐色圓形或不規則形病斑，病斑周圍
根腐 (root rot)、莖腐 (stalk rot)、葉斑 (leaf
有淡黃色暈環，有時會在葉片基部產生黑褐化
spot)、葉片枯萎 (leaf blight)、葉片腐爛 (leaf
大型病斑，甚或造成芽體枯萎現象，嚴重影響
rot)、幼鞘腐爛 (sheath rot) 及維管束萎凋
植株的商品價值。本試驗由葉細斑病病斑進行
(vascular wilt) 等病徵表現，其中具病原性鐮
組織分離純化後，經培養特性、核酸序列比對
孢菌 (Fusarium spp.) 是栽培高經濟蘭花主要
及柯霍式法則確定引起小花蕙蘭葉細斑病之病
限制因子之一 (Srivastava et al. 2018)。對蘭
原為 F. proliferatum。在美國、日本、澳洲、 花具病原性鐮孢病菌包含 F. proliferatum、
德國及韓國皆曾報導，F. proliferatum為蘭花 F. oxysporum、F. solani、F. subglutinans, F.
病原菌之一，不僅危害蕙蘭 (Cymbidium)， fractiflexum 及 F.circinatum 等 (Latiffah et al.
亦對齒舌蘭 (Odontioda)、石斛蘭 (Dendrobi- 2009; Srivastava et al. 2018; Wang et al. 2018)，
um)、文心蘭 (Oncidium) 及嘉得麗雅蘭 (Cat- 其中以F. proliferatum為台灣小花蕙蘭葉部病
tleya) 等造成黑褐色、黃色葉部病斑；在蕙蘭 害主要病原菌之一。本研究測試溫度對F. pro-
(Cymbidium)、石斛蘭 (Dendrobium) 及蝴蝶蘭 liferatum 分離株菌絲生長與孢子發芽的影響，
(Phalaenopsis) 造成莖部與根部腐爛 (Chang 結果發現24–28℃為本菌菌絲生長最適溫度，
et al. 1998; Ichikawa & Aoki 2000; Latiffah et 20–32℃為本菌孢子發芽最適溫度，顯示本菌
al. 2009; Zakaria et al. 2009; Swett & Uchi- 適應溫度範圍廣，台灣的亞熱帶氣候條件下有
da 2015; Srivastava et al. 2018; Wang et al. 利本病原菌之發芽與侵染。
2018)。在鐮孢菌屬 (Fusarium) 中，引起蕙蘭 於 Fp-172 菌株病原性測試結果，指出
(Cymbidium) 葉片產生病斑 (leaf spot) 之病原 該菌株對報歲蘭 (C. sinense)、春蘭 (C. go-
除了 F. proliferatum 外，還包含 F. fractiflex- eringii) 及四季蘭 (C. ensifolium) 「( 富山」、「市
um與F. subglutinans，其中F. fractiflexum感 長紅」、「彩虹」及「鐵骨素心」) 均具有病原性，
染葉片產生黃色病斑；而F. subglutinans則初 以罹病度來看，對四季蘭的病原性較強，且由
期產生細小黃斑，漸漸地轉變成黑褐色至黑色 試驗結果顯示，F. proliferatum 對小花蕙蘭目
病斑、病斑外圍具黃暈，逐漸擴大呈黑褐色凹 前主力品種四季蘭與報歲蘭皆具有威脅性，應
陷病斑，病斑邊緣微凸起狀，後期老舊病斑中 注意防治。另外，從文獻得知，鐮孢菌屬 (Ge-
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4433 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::009944 台灣農業研究　第71卷　第1期
nus Fusarium) 易危害種苗及幼嫩芽部位，當 位，田間栽培時應特別注意F. proliferatum之
幼嫩植株被鐮孢病菌侵入感染後，不利於植株 侵染，加強田間防治作業，避免植株失去商品
生長，有時甚至出現死亡，造成植株嚴重損失 價值而造成嚴重損失。未來仍待持續進行如化
(Srivastava et al. 2018)。從台灣田間病害發生 學防治、物理防治或生物防治等防治方法的評
情形觀察，初步得知F. proliferatum引起的細 估，期能提供防治本病害之有效解決方案。
斑病主要好發於新芽、嫩葉時期，與國外有類
似現象；又小花蕙蘭幼葉生長健康與否，與植 誌謝
株商品價值直接相關，因此為了進一步瞭解幼
本研究工作承黎貴枝小姐、張立詳小姐、
葉葉齡對本病原菌之感受性，以人工接種方式
鄭淑貞小姐及曾淑瓊小姐協助試驗進行，特此
將 F. proliferatum 孢子懸浮液噴施於「彩虹」
致謝。
四季蘭之不同齡期幼葉上，評估該病原對各齡
期葉片之感受性差異，可作為後續防治葉細斑
引用文獻
病時確實掌握最佳防治時機之依據。由試驗結
果得知，新芽萌發到生長2 wk至1 mo (冒新 Aoki, T., K. O’Donnell, and K. Ichikawa. 2001. Fusarium
fractiflexum sp. nov. and two other species within
芽至1–2分芽) 幼葉齡期時其細斑病罹病度高
the Gibberella fujikuroi species complex recently
達 52% 以上，2.5 mo (5 分芽) 幼葉葉齡期時
discovered in Japan that form aerial conidia in false
仍有25%罹病度，但3.5 mo (8分芽) 幼葉齡 heads. Mycoscience 42:461−478. doi:10.1007/
期齡期時其細斑病罹病度降至 15% 以下，而 BF02464343
幼葉轉成成熟葉片時則細斑病皆不發生。值得 Broadhurst, P. G. 1996. Occurrence of Fusarium subglu-
tinans on Cymbidium orchids in New Zealand. Plant
注意的是，在進行F. proliferatum細斑病菌對
Dis. 80:711. doi:10.1094/PD-80-0711D
不同小花蕙蘭品種接種測試時，未在四季蘭、
Chang, M., I. K. Hyun, Y. H. Lee, and D. H. Lee. 1998.
報歲蘭及春蘭之成熟葉片上觀察到細斑病病徵 Leaf spot of Cymbidium hybrida caused by Fu-
的產生。另外，幼葉齡期被細斑病菌感染後， sarium proliferatum. Korean J. Plant. Pathol.
14:664−667. (in Korean with English abstract)
逐漸生長為成熟葉，再從成熟葉上病斑進行分
Chen, U. C., J. H. Huang, and T. F. Hsieh. 2015. Effect of
離，仍然可分離到細斑病菌，顯示此病原菌可
rainproof rolling blinds on improvement of disease
殘存在成熟葉片上，且可能仍具有感染力，因 prevention of oriental cymbidium. p.111−125. in:
此建議本病害防治仍應將出現病徵的幼葉及成 Proceeding of Chinese Cymbidium Industry Con-
ference. November 17, 2015. Nantou, Taiwan. Tai-
熟葉一併摘除並帶離園區，以降低田間感染源
chung Dist. Agric. Res. Ext. Sta. Publ., Taichung,
密度。 Taiwan. (in Chinese)
本研究報導台灣小花蕙蘭葉細斑病主要由 Cong, L. L., Y. Sun, J. M. Kang, M. N. Li, R. C. Long, T. J.
F. proliferatum 病原所引起，除 F. prolifera- Zhang, and Q. C. Yang. 2016. First report of root rot
disease caused by Fusarium proliferatum on alfalfa
tum 外，是否還有其他種類鐮孢菌屬病原，又
in China. Plant Dis. 100:2526. doi:10.1094/PDIS-
其發病生態、生長適溫及寄主作物感受性是否 04-16-0505-PDN
有所差異，仍有待未來進一步探討。目前小花 Du Puy, D. and P. Cribb. 2007. The Genus Cymbidium.
蕙蘭之主要栽培品種 (品系) 皆屬於感病品種， Kew Publishing. Kew, UK. 369 pp.
如報歲蘭、四季蘭之「富山」、「鐵骨」、「彩 Geiser, D. M., M. del Mar Jiménez-Gasco, S. Kang, I.
Makalowska, N. Veeraraghavan, T. J. Ward, N.
虹」及「市長紅」等。有關各齡期葉片對本病
Zhang, G. A. Kuldau, and K. O’Donnell. 2004. FU-
原菌之感病性試驗，結果顯示新芽萌發生長2 SARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for
wk至1.5 mo (剛冒新芽至 3分芽) 時期為本病 identifying Fusarium. Eur. J. Plant Pathol. 110:473–
479. doi:10.1023/B:EJPP.0000032386.75915.a0
害好發時機，隨著嫩芽幼葉越趨成熟，則對本
Han, K. S., J. H. Park, C. G. Back, and M. J. Park.
病原菌越具耐病性，因此得知小花蕙蘭於抽梢
2015. First report of Fusarium subglutinans caus-
期 (春梢期、秋梢期) 之嫩芽、嫩葉為感病部 ing leaf spot disease on Cymbidium orchids in
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4444 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::1100小花蕙蘭葉細斑病 45
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Characteristics of Growth and Infection of Fusarium
proliferatum Causing Fleck Spot on Oriental
Cymbidium Leaf in Taiwan
Chiao-Wen Huang1,*, Jin-Hsing Huang2, and Ting-Fang Hsieh3
Abstract
Huang, C. W., J. H. Huang, and T. F. Hsieh. 2022. Characteristics of growth and infection
of Fusarium proliferatum causing fleck spot on oriental cymbidium leaf in Taiwan. J.
Taiwan Agric. Res. 71(1):35–47.
Fleck spot disease is critical for oriental cymbidium cultivation owing to decreasing the ap-
pearance quality of plants. The main symptom is circular or irregular fleck lesions in black to brown
on young leaves with or without a yellowish halo around the lesions. Occasionally in severe disease
conditions, young shoots showed browning rot of basal leaves and shoot death. A species of fungus
was isolated from the diseased tissue and identified as Fusarium proliferatum based on morphological
characters, nucleotide sequence comparison of internal transcribed spacer (ITS), and translation elon-
gation factor 1 alpha (TEF-1α) gene. Pathogenicity tests were carried out by artificial inoculation with
conidial suspensions of the tested fungus to fulfill Koch’s postulates. The optimal temperatures for
mycelial growth and spore germination of F. proliferatum were 24−28℃ and 20−32℃, respectively.
Seven oriental cymbidium cultivars including Cymbidium ensifolium, C. sinense and C. goeringii,
showed brown-to-black fleck lesions on young leaves, but no symptom appeared on mature leaves
after artificial inoculation. To investigate the effect of shoot age on the susceptibility of fleck spot dis-
ease, potted oriental cymbidium (C. ensifolium ‘Tsai-hong’ cultivar) contained different ages of shoots
were inoculated with conidial suspension at 28℃. Results showed that disease severities of 0.5, 1.0,
1.5, 2.5, 3.5 and 4.5-month-old of shoots were 58.3−59.3%, 52.8−62.5%, 29.2−49.3%, 13.9−25.9%,
2.8−14.6% and 0%, respectively; whereas the adult shoots showed no fleck spot symptoms. The
above results might provide the information for controlling fleck spot of oriental cymbidium caused
by F. proliferatum.
Key words: Oriental cymbidium, Fleck spot, Fusarium proliferatum.
Received: August 11, 2021; Accepted: October 15, 2021.
* Corresponding author, e-mail: cwhuang@tari.gov.tw
1 Assistant Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
2 Associate Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan, ROC.
3 Research Fellow and Division Director, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung City, Taiwan,
ROC.
臺臺灣灣農農業業研研究究7711((11))--0044 黃黃巧巧雯雯..iinndddd 4477 22002222//33//1188 下下午午 0066::1122::1100